{"id":99850,"date":"2018-03-11T10:21:05","date_gmt":"2018-03-11T10:21:05","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/evaluacion-de-la-viabilidad-y-caracterizacion-genetica-de-celulas-endoteliales-transdiferenciadas-a-partir-de-celulas-madre-de-la-gelatina-de-wharton\/"},"modified":"2018-03-11T10:21:05","modified_gmt":"2018-03-11T10:21:05","slug":"evaluacion-de-la-viabilidad-y-caracterizacion-genetica-de-celulas-endoteliales-transdiferenciadas-a-partir-de-celulas-madre-de-la-gelatina-de-wharton","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/cultivo-de-tejidos\/evaluacion-de-la-viabilidad-y-caracterizacion-genetica-de-celulas-endoteliales-transdiferenciadas-a-partir-de-celulas-madre-de-la-gelatina-de-wharton\/","title":{"rendered":"Evaluaci\u00f3n de la viabilidad y caracterizaci\u00f3n gen\u00e9tica de c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas a partir de c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton"},"content":{"rendered":"

Tesis doctoral de Manuel Vico <\/strong><\/h2>\n

La ingenier\u00eda tisular es un nuevo campo de la medicina que est\u00e1 centrado principalmente en la creaci\u00f3n de tejidos artificiales para su utilizaci\u00f3n como herramientas terap\u00e9uticas. Para conseguir su objetivo la ingenier\u00eda tisular necesita una fuente adecuada de c\u00e9lulas que sean funcionales y viables, as\u00ed como biomateriales y se\u00f1ales moleculares de distinta naturaleza. De este modo, para crear tejidos artificiales necesitamos aislar c\u00e9lulas con capacidad proliferativa, que se obtienen habitualmente de biopsias de tejido adulto o del cord\u00f3n umbilical humano, siendo este \u00faltimo una fuente de c\u00e9lulas madre de f\u00e1cil acceso y con un gran potencial de diferenciaci\u00f3n. Las c\u00e9lulas de wharton, existentes a nivel de la gelatina de cord\u00f3n umbilical, son un tipo de c\u00e9lula mesenquimal con potencial terap\u00e9utico que se puede inducir in vitro hacia diferentes tipos de c\u00e9lulas. en angiolog\u00eda y cirug\u00eda vascular la construcci\u00f3n de sustitutos eficientes de los vasos sangu\u00edneos es un objetivo prioritario. En este sentido se han aplicado diferentes t\u00e9cnicas de ingenier\u00eda tisular, con el fin de obtener nuevos modelos de sustitutos vasculares que mejoren la calidad de los injertos, ya que uno de los factores limitantes m\u00e1s importantes a la hora de desarrollar un sustituto vascular mediante ingenier\u00eda tisular es el generar una superficie en la luz vascular cuya estructura sea lo m\u00e1s parecida posible al endotelio vascular natural y que sea capaz de ejercer las mismas funciones antitrombog\u00e9nicas. As\u00ed, mediante el desarrollo de cultivos y cocultivos celulares de elementos de car\u00e1cter endotelial, obtenemos c\u00e9lulas susceptibles de ser utilizadas como revestimiento de injertos artificiales. Aunque se ha demostrado que las c\u00e9lulas endoteliales son una fuente de c\u00e9lulas viables, su viabilidad s\u00f3lo se mantiene en un grado aceptable en los primeros pases celulares, siendo su capacidad de proliferaci\u00f3n por lo tanto limitada. Debido a esto, es fundamental encontrar fuentes de c\u00e9lulas para ser utilizadas en ingenier\u00eda tisular vascular con una gran capacidad de supervivencia. De este modo, se han propuesto algunas fuentes de c\u00e9lulas substitutivas del endotelio, como son la sangre del cord\u00f3n umbilical y el tejido adiposo. Otra de las fuentes de c\u00e9lulas que recientemente ha despertado el inter\u00e9s de la comunidad cient\u00edfica se encuentra tambi\u00e9n en el cord\u00f3n umbilical, nos referimos concretamente las c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton. Las caracter\u00edsticas que hacen que estas c\u00e9lulas sean una fuente interesante son sus elevados niveles de proliferaci\u00f3n en cultivo y la capacidad para diferenciarse o transdiferenciarse en un gran n\u00famero de tipos celulares (potencial diferenciativo). Adem\u00e1s, tiene las ventajas de ser una fuente que es accesible, el no ser doloroso el proceso de obtenci\u00f3n, el ser una fuente de c\u00e9lulas aut\u00f3logas y el bajo riesgo de contaminaci\u00f3n viral. a este respecto, la presente tesis doctoral tiene por objeto obtener c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas (cet) a partir de las c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton del cord\u00f3n umbilical humano, con el fin de ser incluidas en protocolos de terapia celular. De este modo, se discute el potencial de transdiferenciaci\u00f3n de las c\u00e9lulas de wharton del cord\u00f3n umbilical humano en c\u00e9lulas endoteliales, as\u00ed como se eval\u00faa su viabilidad celular y su caracterizaci\u00f3n gen\u00e9tica. Para ello, se describe en la introducci\u00f3n la histolog\u00eda del cord\u00f3n umbilical y sus posibles usos terap\u00e9uticos, las caracter\u00edsticas de la c\u00e9lula de wharton y los principales m\u00e9todos que se utilizan para determinar la viabilidad de las c\u00e9lulas mantenidas en cultivo, incluyendo la microscop\u00eda electr\u00f3nica anal\u00edtica y la expresi\u00f3n g\u00e9nica celular. evaluar la viabilidad y la expresi\u00f3n g\u00e9nica de las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas a partir de c\u00e9lulas de wharton constituye el objetivo principal de la presente tesis doctoral, para lo cual se plantearon los siguientes objetivos espec\u00edficos: -aislar y establecer cultivos primarios de c\u00e9lulas huvec y c\u00e9lulas de wharton del cord\u00f3n umbilical humano; -determinar los patrones microanal\u00edticos y de expresi\u00f3n g\u00e9nica de las c\u00e9lulas huvec y de wharton aisladas del cord\u00f3n umbilical humano; -transdiferenciar c\u00e9lulas de wharton en c\u00e9lulas endoteliales; -determinar los patrones microanal\u00edticos y de expresi\u00f3n g\u00e9nica de las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas; y -determinar la viabilidad celular de las c\u00e9lulas transdiferenciadas para su utilizaci\u00f3n en ingenier\u00eda tisular. por todo ello, en la presente tesis doctoral se estudia la transdiferenciaci\u00f3n de las c\u00e9lulas de wharton hacia c\u00e9lulas endoteliales, analizando su fenotipo, su viabilidad y su actividad funcional. Para esto hemos utilizado t\u00e9cnicas microsc\u00f3picas que nos permiten comprobar el fenotipo de las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas, microan\u00e1lisis que nos permite establecer la viabilidad de dichas c\u00e9lulas, y por \u00faltimo, t\u00e9cnicas de expresi\u00f3n g\u00e9nica que nos posibilita el conocimiento de la actividad funcional de las mismas. para estudiar las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas a partir de las c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton, se establecieron cultivos celulares primarios y subcultivos de c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton y c\u00e9lulas endoteliales de la vena del cord\u00f3n umbilical humano (huvec) a partir cordones umbilicales obtenidos de partos por ces\u00e1rea de mujeres gestantes a t\u00e9rmino, que aceptaron participar en el estudio mediante consentimiento informado. posteriormente las c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton se cultivaron y subcultivaron en el mismo medio que las c\u00e9lulas endoteliales para su an\u00e1lisis microanal\u00edtico y gen\u00e9tico. De este modo conseguimos transdiferenciar de modo eficiente las c\u00e9lulas de wharton a c\u00e9lulas endoteliales. Con el objeto de determinar la eficacia de esta transdiferenciaci\u00f3n, se estudi\u00f3 el fenotipo morfol\u00f3gico mediante microscop\u00eda \u00f3ptica y electr\u00f3nica de barrido, y el fenotipo gen\u00e9tico, a trav\u00e9s de la identificaci\u00f3n de patrones de expresi\u00f3n g\u00e9nica endotelial. en primer lugar, nuestros estudios permitieron realizar una evaluaci\u00f3n histol\u00f3gica tanto con microscop\u00eda \u00f3ptica como con microscop\u00eda electr\u00f3nica de barrido de las c\u00e9lulas de los diferentes cultivos, comprobando que la morfolog\u00eda de las c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton (morfolog\u00eda fusiforme o estrellada, con n\u00facleo voluminoso y nucl\u00e9olos prominentes) fue modific\u00e1ndose hasta alcanzar una morfolog\u00eda redondeada, con n\u00facleos voluminosos y nucl\u00e9olos prominentes, semejante a las c\u00e9lulas huvec. Esto demuestra que las cet adoptan una morfolog\u00eda similar a las c\u00e9lulas nativas endoteliales. en segundo lugar, el an\u00e1lisis de genes espec\u00edficos de funci\u00f3n y fenotipo endotelial demostr\u00f3 que varios genes y marcadores endoteliales se sobre-expresaron en las cet. Aunque no todos los genes endoteliales se sobre-expresaron en el mismo nivel que las c\u00e9lulas huvec, muchos de los mismos mostraron un claro aumento tras la inducci\u00f3n, sugiriendo que el proceso de transdiferenciaci\u00f3n endotelial se hab\u00eda activado. Adem\u00e1s, el an\u00e1lisis revel\u00f3 que el incremento porcentual de la expresi\u00f3n g\u00e9nica aument\u00f3 significativamente m\u00e1s en algunos genes y funciones que en otros, lo que sugiere que puede existir un patr\u00f3n jer\u00e1rquico en el proceso de transdiferenciaci\u00f3n hacia las c\u00e9lulas de fenotipo endotelial. por otro lado, el an\u00e1lisis de los genes implicados en la diferenciaci\u00f3n celular endotelial y en el fenotipo endotelial revel\u00f3 que el proceso de transdiferenciaci\u00f3n fue eficaz desde un punto de vista estructural. De modo similar, un importante n\u00famero de genes relacionados con el fenotipo y la diferenciaci\u00f3n endotelial demostraron una sobreexpresi\u00f3n importante tras la inducci\u00f3n. adem\u00e1s, hemos analizado la expresi\u00f3n de varios genes relacionados con importantes funciones endoteliales tales como la antiagregaci\u00f3n, anticoagulaci\u00f3n y regulaci\u00f3n del tono vascular. En general, los resultados muestran que muchos de esos genes se sobre-expresaron tras la inducci\u00f3n hacia el fenotipo endotelial, pero la expresi\u00f3n de dichos genes alcanz\u00f3 en muchos casos un nivel muy bajo comparativamente con el que expresaron las c\u00e9lulas huvec. Esto sugiere que las cet a\u00fan no son funcionales. una vez demostrada la eficacia de la transdiferenciaci\u00f3n de las c\u00e9lulas de wharton hacia c\u00e9lulas endoteliales, se estudi\u00f3 la viabilidad de las mismas desde dos puntos de vista: el estudio con microan\u00e1lisis y el estudio de funciones g\u00e9nicas asociadas, centr\u00e1ndonos en las funciones relacionadas con apoptosis y muerte celular. para el estudio de la viabilidad celular mediante microscop\u00eda electr\u00f3nica anal\u00edtica por energ\u00eda dispersiva de rayos x, utilizamos c\u00e9lulas correspondientes a los tres primeros pases de cultivos celulares de las c\u00e9lulas de wharton, c\u00e9lulas huvec y cet. conocemos por estudios realizados en nuestro departamento que existen patrones i\u00f3nicos espec\u00edficos para las c\u00e9lulas viables, c\u00e9lulas en necrosis y c\u00e9lulas en apoptosis, siendo las concentraciones intracelulares de sodio y potasio uno de los indicadores m\u00e1s sensibles y fiables de viabilidad celular. Por otro lado, roomans sugiere que la raz\u00f3n o cociente k\/na es un excelente indicador de la viabilidad celular. en este sentido, los resultados obtenidos referentes al cociente k\/na de las c\u00e9lulas de wharton en los tres primeros pases fue de 2,39, de las c\u00e9lulas huvec 4,04 y el de las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas de 9,41, indicando el alto grado de viabilidad de estas \u00faltimas. el segundo m\u00e9todo utilizado para evaluar la viabilidad de las cet en la presente tesis doctoral ha sido el estudio de la expresi\u00f3n g\u00e9nica mediante microarrays de oligonucle\u00f3tido. Para ello, una vez obtenidos los genes sobre-expresados en cada tipo celular, se analizaron las funciones g\u00e9nicas asociadas, demostrando que los genes sobre-expresados en las c\u00e9lulas de wharton correspondieron a 134 funciones g\u00e9nicas sobre-representadas, de las que un 3,7% correspondieron a mecanismos de apoptosis y muerte celular. Los genes sobre-expresados en las c\u00e9lulas huvec, correspondieron a 127 funciones g\u00e9nicas sobre-representadas, de las cuales un 3,1% est\u00e1n relacionadas con apoptosis y muerte celular. Sin embargo, los genes sobre-expresados en las cet, y que correspondieron a 126 funciones g\u00e9nicas, no se relacionaron con ninguna funci\u00f3n asociada a apoptosis y muerte celular. Estos resultados, que demuestran una clara disminuci\u00f3n de funciones g\u00e9nicas relacionadas con apoptosis en las cet, corroboran los encontrados con microan\u00e1lisis, en los que el cociente k\/na indicaban una mayor viabilidad de las cet respecto a las c\u00e9lulas de wharton y a las huvec. como se indic\u00f3 inicialmente, la transdiferenciaci\u00f3n de las c\u00e9lulas de wharton en c\u00e9lulas endoteliales se analiza a trav\u00e9s del fenotipo, de la viabilidad y a trav\u00e9s de la actividad funcional. en lo que respecta a la evaluaci\u00f3n de la actividad funcional de las cet, se realizad\u00f3 un an\u00e1lisis de expresi\u00f3n g\u00e9nica en los distintos cultivos celulares utilizando microarrays de oligonucle\u00f3tidos, centrando la atenci\u00f3n en la expresi\u00f3n gen\u00e9tica en cada tipo celular, lo que nos permite evaluar la citodiferenciaci\u00f3n y la actividad celular. al analizar la expresi\u00f3n g\u00e9nica y compararla entre los distintos tipos, encontramos algunas funciones g\u00e9nicas sobre-representadas en las cet respecto a las c\u00e9lulas de wharton relacionadas con la presentaci\u00f3n de ant\u00edgeno, actividad del receptor mhc clase ii y procesamiento del ant\u00edgeno. al comparar la expresi\u00f3n g\u00e9nica de las c\u00e9lulas de wharton respecto a las cet y obtener como resultado una sobre-expresi\u00f3n de genes en estas c\u00e9lulas relacionados con la presentaci\u00f3n y procesamiento del ant\u00edgeno, as\u00ed como con la actividad del receptor mhc clase ii (que no se expresan en las c\u00e9lulas de wharton) se demuestra que las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas adoptan caracter\u00edsticas inmunol\u00f3gicas t\u00edpicas de la c\u00e9lula endotelial ortot\u00edpica. el estudio realizado permite demostrar que las c\u00e9lulas de wharton del cord\u00f3n umbilical constituyen una fuente de c\u00e9lulas madre susceptibles de transdiferenciarse a c\u00e9lulas endoteliales vasculares con niveles adecuados de viabilidad y funcionalidad, aptas para su posible utilizaci\u00f3n terap\u00e9utica. los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral nos permiten establecer las siguientes conclusiones: 1.\tLos m\u00e9todos y t\u00e9cnicas desarrollados y utilizados en la presente tesis doctoral permiten el aislamiento de las c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton del cord\u00f3n umbilical humano y de las c\u00e9lulas huvec, as\u00ed como su mantenimiento hasta el tercer subcultivo, sin que dicho aislamiento y mantenimiento generen alteraciones artefactuales significativas. 2.\tLas t\u00e9cnicas de microscop\u00eda electr\u00f3nica anal\u00edtica por energ\u00eda dispersiva de rayos x utilizadas en la presente tesis doctoral nos permiten determinar la existencia de un patr\u00f3n microanal\u00edtico diferenciado entre las c\u00e9lulas de wharton y las c\u00e9lulas huvec, las cuales presentan unos niveles de concentraci\u00f3n i\u00f3nica (mg, p, s, cl, k, ca) significativamente m\u00e1s elevados que las primeras, a excepci\u00f3n del sodio. 3.\tLas t\u00e9cnicas de microarray utilizadas en la presente tesis doctoral nos permiten determinar que, en relaci\u00f3n con el patr\u00f3n de expresi\u00f3n g\u00e9nica, existe un mayor n\u00famero de funciones g\u00e9nicas vinculadas con el crecimiento y la proliferaci\u00f3n en las c\u00e9lulas de wharton que en las c\u00e9lulas huvec, observ\u00e1ndose en ambas un n\u00famero similar de funciones g\u00e9nicas relacionadas con la apoptosis y la muerte celular. 4.\tEl m\u00e9todo descrito en la presente tesis doctoral, que tiene por base el cultivo de las c\u00e9lulas de wharton en un medio selectivo de diferenciaci\u00f3n endotelial, permite transdiferenciar las c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton en c\u00e9lulas de fenotipo endotelial de acuerdo con criterios morfoestructurales, determinados mediante t\u00e9cnicas de microscop\u00eda \u00f3ptica y microscop\u00eda electr\u00f3nica de barrido, y de expresi\u00f3n g\u00e9nica, determinados mediante t\u00e9cnicas de microarray. 5.\tLas t\u00e9cnicas de microscop\u00eda electr\u00f3nica anal\u00edtica por energ\u00eda dispersiva de rayos x utilizadas en la presente tesis doctoral nos permiten determinar la existencia de un patr\u00f3n microanal\u00edtico caracter\u00edstico de las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas. Dichas c\u00e9lulas presentan, en comparaci\u00f3n con las c\u00e9lulas de wharton, una disminuci\u00f3n significativa en los niveles intracelulares de sodio y un aumento en los niveles del f\u00f3sforo y del calcio y, en comparaci\u00f3n con las c\u00e9lulas huvec, unos niveles de concentraci\u00f3n i\u00f3nica significativamente m\u00e1s bajos en todos los elementos analizados (na,mg, p, s, cl, k) a excepci\u00f3n del calcio. 6.\tLas t\u00e9cnicas de microarray utilizadas en la presente tesis doctoral nos permiten determinar que en relaci\u00f3n con el patr\u00f3n de expresi\u00f3n g\u00e9nica de las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas existe, en comparaci\u00f3n con las c\u00e9lulas de wharton, una sobre-expresi\u00f3n g\u00e9nica de diferentes marcadores endoteliales y de diversas funciones g\u00e9nicas relacionadas con la respuesta inmune, concretamente con el proceso y presentaci\u00f3n del ant\u00edgeno, as\u00ed como de los genes relacionados con la actividad del receptor mhc clase ii, lo que confirma la naturaleza transdiferenciada de estas c\u00e9lulas en el contexto inmunol\u00f3gico del organismo. La comparaci\u00f3n de funciones g\u00e9nicas entre las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas y las de las c\u00e9lulas huvec muestra que no existen diferencias significativas, lo que confirma la similitud citofuncional de ambos elementos celulares. Las c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas, a diferencia de las c\u00e9lulas de wharton y de las c\u00e9lulas huvec, no presentan funciones g\u00e9nicas relacionadas con la apoptosis ni con la muerte celular. 7.\tLa transdiferenciaci\u00f3n de las c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton a c\u00e9lulas endoteliales genera elementos celulares con alta viabilidad de acuerdo con los perfiles i\u00f3nicos y de expresi\u00f3n g\u00e9nica determinados en la presente tesis doctoral, lo que convierte a dichos elementos en c\u00e9lulas potencialmente \u00fatiles en la ingenier\u00eda tisular aplicada al sistema vascular.<\/p>\n

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Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00abEvaluaci\u00f3n de la viabilidad y caracterizaci\u00f3n gen\u00e9tica de c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas a partir de c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton<\/strong>\u00ab<\/h3>\n
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  • T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Evaluaci\u00f3n de la viabilidad y caracterizaci\u00f3n gen\u00e9tica de c\u00e9lulas endoteliales transdiferenciadas a partir de c\u00e9lulas madre de la gelatina de wharton <\/li>\n
  • Autor:<\/strong>\u00a0 Manuel Vico <\/li>\n
  • Universidad:<\/strong>\u00a0 Granada<\/li>\n
  • Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 19\/03\/2010<\/li>\n<\/ul>\n

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    Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n
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    • Director de la tesis<\/strong>\n
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      • Antonio Campos Mu\u00f1oz<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n
      • Tribunal<\/strong>\n
          \n
        • Presidente del tribunal: ignacio P\u00e9rez de vargas ferroni <\/li>\n
        • pascual vicente Crespo ferrer (vocal)<\/li>\n
        • ricardo Fernandez valades (vocal)<\/li>\n
        • Jos\u00e9 Pe\u00f1a amaro (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n

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