Tesis doctoral de Raquel Moreno Loshuertos
En los últimos años se han identificado gran cantidad de mutaciones puntuales y deleciones mtdna que causan enfermedades humanas. Estas mutaciones se han asociado a un amplio espectro de manifestaciones clínicas que cursan mayoritariamente con disfunciones neurológicas degenerativas, incluyendo ceguera, sordera, demencia, desórdenes del movimiento, ataxia, y encefalopatías en general. Además de las mutaciones patológicas, se han descrito numerosas variantes polimórficas del mtdna que se han considerado inicialmente como sustituciones neutras producto de la evolución y que se generan y fijan en lugares geográficos determinados. Desde hace algún tiempo, algunas de estas variantes han dejado de considerarse neutras puesto que, si bien no producen patologías por sí mismas, sí parecen tener consecuencias fenotípicas. Así, se han asociado con determinados fenotipos como la longevidad, la motilidad espermática, la adaptación al frío e incluso con distintos grados de susceptibilidad o penetrancia de enfermedades mitocondriales o en las que la mitocondria juega un papel importante. Aunque la capacidad de detección y diagnóstico de alteraciones en el mtdna ha progresado rápidamente, no existe todavía tratamiento para estas enfermedades, debido, principalmente a la falta de comprensión de los mecanismos moleculares que relacionan determinada mutación con un fenotipo. el estudio de los mecanismos moleculares de las enfermedades asociadas a mutaciones en el mtdna sólo se ha podido realizar en modelos celulares de dichas patologías. El desarrollo de modelos animales, imprescindible para comprender estas enfermedades y abordar estrategias terapéuticas, se ha visto dificultado por diversas barreras técnicas. Entre ellas destaca la imposibilidad de transformar mitocondrias con dna exógeno, lo que ha impedido el diseño de técnicas de mutagénesis dirigida que ayuden a imitar las mutaciones observadas en humanos. Este hecho, unido a la ausencia de mutaciones naturales en ratón y a la barrera interespecífica, que no permite utilizar mitocondrias obtenidas de pacientes humanos en modelos animales, ha dificultado la generación de estas herramientas. Recientemente, sin embargo, se ha publicado la generación de los primeros ratones portadores de mutaciones en su mtdna, mediante transferencia a embriones de mitocondrias provenientes de una línea celular inmortalizada con mutaciones preexistentes en su mtdna. en nuestro grupo, se ha desarrollado un método de generación y selección de mutaciones aleatorias en el mtdna de células de ratón en cultivo y se han obtenido mutaciones en distintos genes mitocondriales que servirán como material de partida para la generación de modelos animales de enfermedades provocadas por alteraciones en el mtdna. el principal objetivo de este trabajo ha sido descifrar tanto los mecanismos moleculares de patogenicidad de las alteraciones en el mtdna como descubrir las implicaciones funcionales de las variantes polimórficas del mismo, las vías de ensamblaje de los distintos complejos y la regulación del sistema oxphos. Por este motivo se ha dividido en dos grandes apartados: variabilidad poblacional y mutaciones patológicas. i. Variabilidad poblacional: este primer apartado constituye el esfuerzo de comprender las asociaciones entre snps (single nucleotide polymorphisms) mitocondriales con diversos fenotipos y se presenta como un recorrido desde las variantes polimórficas neutras hasta aquéllas que, sin ser patológicas per se, parecen predisponer a la aparición de enfermedades. a) variantes polimórficas neutras: con la finalidad de explicar las diferencias fenotípicas observadas en ratones portadores de diferentes variantes de mtdna y estudiar la implicación de estos factores genéticos en la función oxphos así como su influencia en la respuesta a fármacos o factores ambientales, hemos analizado la función mitocondrial de líneas celulares portadoras de distintas variantes de mtdna en un mismo entorno nuclear. así, hemos confirmado que las variantes no patológicas del mtdna de ratón que parecen predisponer a menor capacidad de aprendizaje o que potencian fenotipos de sordera en combinación con mutaciones en el genoma nuclear, tienen una capacidad respiratoria similar a otras variantes. Sin embargo, hemos puesto de manifiesto que esta similitud en función oxphos, esconde variaciones en la eficiencia de la cadena de transporte electrónico mitocondrial que se revelan como diferencias en la producción de h2o2, disminución de la actividad de enzimas del ciclo de krebs sensibles a ros (aconitasa y a-kgdh) y aumento de la actividad de las enzimas encargadas de su detoxificación (catalasa y mnsod). Estas observaciones quedan validadas por el efecto de los scavengers de ros (nac y tiron) sobre la capacidad oxphos, la biogénesis mitocondrial y el crecimiento en galactosa. Además hemos identificado como causa genética responsable de estas diferencias funcionales, la variación en longitud de un track de nucleótidos de adenina en el gen mt-tr que varía entre 8 y 10 (ó 9a + 1t) y provoca que el tamaño del bucle dhu del trna maduro varíe entre 5 y 7 nucleótidos y, como causa molecular, la disminución moderada de la tasa de síntesis de proteínas mitocondriales que sólo se manifiesta cuando tratamos las células con compuestos que la inhiben específicamente. b) variantes genéticas con efectos funcionales moderados: dentro del grupo de enfermedades que presentan cierta asociación con variantes genéticas mitocondriales se encuentran procesos tan complejos como el cáncer , la esclerosis múltiple , el parkinson o el alzheimer. en nuestro análisis nos hemos interesado en la evaluación de la implicación del mtdna como marcador activo del proceso de formación de tumores por lo que hemos buscado variantes genéticas mitocondriales mediante secuenciación completa del mtdna de 13 líneas celulares derivadas de cánceres humanos. Una vez filtrados todos los polimorfismos conocidos del mtdna, se identificaron varias mutaciones que podían tener una relevancia especial. Tras buscar la presencia de estas modificaciones en biopsias de tumores procedentes de pacientes de cáncer y caracterizarlas bioquímicamente en cíbridos transmitocondriales, se encontraron dos mutaciones en el mtdna funcionalmente relevantes: una mutación nueva, localizada en el gen de mt-ts2 (m.12440delc), y un cambio recurrente en el gen mt-co1 (m.6267 g>a), presente en tumores (3/387) así como en varias líneas celulares tumorales (3/13) y en muestras de dna de tejido no tumoral de pacientes con cáncer y prácticamente ausente en controles (1/2264). hemos demostrado que la mutación en mt-co1 provoca una alteración en la función oxphos que se manifiesta como disminución de la actividad cox, se asocia específicamente con cáncer y presenta frecuencias similares a mutaciones patológicas del mtdna. Al igual que otras mutaciones mitocondriales, aparece de manera recurrente y se encuentra en 5 haplogrupos diferentes, indicando eventos de mutación diferentes. Además, se ha encontrado en muestras de tejido no tumoral de los pacientes que presentaban el tumor, lo que sugeriría que se trata de una mutación que favorecería el desarrollo del cáncer. ii. Mutaciones patológicas: a) mutaciones patológicas con distinta penetrancia: casi la mitad de las más de 250 mutaciones descritas en el mtdna humano, se encuentran en genes que codifican trnas y en todos ellos han aparecido sustituciones en, al menos, una posición. Sin embargo, hasta la fecha no se han descrito mutaciones en genes mitocondriales que afecten a la síntesis de proteínas en ratón. mediante mutagénesis aleatoria y selección positiva, hemos generado y caracterizado el primer mutante en un trna mitocondrial en células de ratón, concretamente en la posición 3739, en el gen del mt-ti, y se localiza en el bucle del anticodón del trna en una zona altamente conservada a lo largo de la evolución. Como corresponde a mutantes en trnas, la línea celular presenta un fenotipo oxphos defectuoso con afectación de todos los complejos, especialmente el i y el iv así como reducción de la capacidad de crecimiento en medio de galactosa. Aunque la disminución de la cantidad de trna en el estado estacionario no es demasiado acusada, sí que hemos encontrado alteraciones en el patrón de aminoacilación del trna mutado que nos hacen sospechar la aparición de una estructura secundaria del trna que no es reconocida por la isoleucil-trna sintetasa, disminuyendo de este modo, la cantidad de trna apto para la síntesis de proteínas. Del mismo modo, hemos observado una reducción moderada de la síntesis de proteínas mitocondriales que, sólo se revela cuando se tratan las células con inhibidores específicos como el cloranfenicol o la pentamidina, y que parece afectar a la estabilidad de los complejos respiratorios que dependen de subunidades codificadas en el mtdna. Cuando estudiamos una mutación patológica similar, encontrada en pacientes humanos, observamos un patrón de aminoacilación y un déficit en la síntesis de proteínas mitocondriales análogo al descrito en ratón. b) mecanismos de competencia entre complejos del sistema oxphos: el otro tema que se ha desarrollado en esta tesis ha sido el análisis detallado de la biogénesis del sistema de la cadena de transporte electrónico y, en concreto, el estudio de la asociación y dependencia entre distintos complejos de la cadena de transporte electrónico con el fin de optimizar el proceso de fosforilación oxidativa. con el objetivo de hallar fenotipos de supresión de la mutación patológica en el gen mt-cytb (m.15263g>a) que provoca un cambio de aminoácido que impide su plegamiento, el ensamblaje del complejo iii y la estabilización del i, la sometimos a mutagénesis aleatoria y selección positiva y encontramos un modelo muy interesante de competencia entre complejos, concretamente entre los complejos i y ii, por asociarse al complejo iii. el carácter supresor del fenotipo mutante que presentaba la nueva línea celular (ma22) se demostró mediante la recuperación parcial tanto del ensamblaje como de la actividad de los complejos i y iii. La caracterización de la línea supresora nos indicó que, una pequeña cantidad de complejo iii ensamblado era suficiente para permitir la estabilización del 60% del complejo i consiguiendo una actividad específica igual al 50% de del control. Además, se observó un aumento significativo en la eficiencia de la ubiquinona para recibir electrones desde el complejo i, así como la disminución de eficiencia en la recepción de electrones provenientes de otras enzimas distintas del complejo i. el aumento del supercomplejo i+iii de la línea celular ma22 podría explicarse como un mecanismo para aumentar la eficiencia de la cadena de transporte electrónico, dado que el complejo iii es indispensable para la estabilización del complejo i y que se encuentra ensamblado en una proporción muy baja. Puesto que la energía que se obtiene a través del transporte de electrones desde el complejo i es mayor que la generada cuando la ubiquinona los recibe de la succinato deshidrogenasa, el complejo iii sería secuestrado nada más ensamblarse por el complejo i, y no quedaría complejo iii libre para asociarse con otros complejos.
Datos académicos de la tesis doctoral «Dna mitocondrial: de la variabilidad poblacional a las mutaciones patológicas«
- Título de la tesis: Dna mitocondrial: de la variabilidad poblacional a las mutaciones patológicas
- Autor: Raquel Moreno Loshuertos
- Universidad: Zaragoza
- Fecha de lectura de la tesis: 18/05/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- José Antonio Enríquez Domínguez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: manuel Lopez perez
- Santiago Lamas peláez (vocal)
- david Comas martínez (vocal)
- jorgina Satrústegui gil-delgado (vocal)
