Tesis doctoral de Sergio Carilla Latorre
En esta tesis utilizamos dictyostelium para la caracterización molecular de mida, un nuevo factor de ensamblaje o estabilidad del complejo i (ci) mitocondrial, así como de c20orf7, otro factor previamente implicado en la función de dicho complejo. la disrupción de los genes mida y c20orf7 produce un defecto aislado de ci como hemos demostrado mediante la medición de cadena respiratoria. El uso de la técnica bn-page en células humanas hek293t, donde se reguló negativamente la expresión del homólogo humano de mida (hmida), muestra también un defecto importante de complejo i ensamblado así como en la actividad. Mediante la técnica de doble híbrido en levadura y confirmación posterior mediante ¿pull-down¿ hemos descubierto que mida y hmida interaccionan con la subunidad de ci ndufs2, tanto de dictyostelium como de humano, sugiriendo la conservación de su función a lo largo de la evolución y su importante papel en el ci. mida es una proteína de función desconocida. Con el objetivo de conocer su posible función realizamos estudios in silico que nos han permitido generar un modelo 3d de nuestra proteína, así como predecir un posible dominio catalítico de unión de s-adenosilmetionina (sam), donador de grupos metilo en reacciones catalizadas por metiltransferasas. Los estudios de mutagénesis dirigida indican que la mutación g170v en este dominio de unión de sam produce una falta de función de la proteína mida, sugiriendo una posible función metiltransferasa. Así mismo, la mutación g86v, en el posible dominio de unión de sam descrito para c20orf7, produce de igual modo una aparente falta de función de la proteína indicando también un posible papel como metiltransferasa. Para avanzar en el conocimiento de la diferente citopatología producida por mutaciones en el gen c20orf7 en pacientes humanos, hemos llevado a cabo la mutagénesis dirigida sobre los residuos homólogos en c20orf7 de dictyostelium resultando en que ambas mutaciones producen una falta de función de la proteína. mida – presenta importantes defectos en fototaxis y termotaxis. Así mismo hemos descrito como la complementación de la cepa mida – con la proteína ¿wild type¿ es capaz de recuperar ambos fenotipos. Por otro lado, la transfección del mutante mida – con una construcción antisentido del gen ampk (¿amp-dependent protein kinase¿) consigue recuperar totalmente el fenotipo de fototaxis y parcialmente el de termotaxis sugiriendo que en mida – ambos fenotipos defectuosos podrían ser causados por la activación crónica de ampk. Por otro lado la medición del flujo autofágico en los mutantes mida – y c20orf7 – indica un aumento respecto al control wt y la presencia de agregados proteícos poliubiquitinados insolubles, similares a los encontrados en enfermedades neurodegenerativas donde la ampk parece jugar un papel importante. el mutante c20orf7 – presenta, junto con los defectos de complejo i, defectos en crecimiento y desarrollo, similares a los hallados previamente para el mutante mida – . La comparación de fenotipos entre ambos mutantes presenta similitudes, pero también diferencias importantes que son discutidas en este trabajo.
Datos académicos de la tesis doctoral ««caracterización molecular de los factores de ensamblaje de complejo i mitocondrial mida y c20orf7 en dictyostelium discoideum»«
- Título de la tesis: «caracterización molecular de los factores de ensamblaje de complejo i mitocondrial mida y c20orf7 en dictyostelium discoideum»
- Autor: Sergio Carilla Latorre
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 21/10/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ricardo Escalante Hernández
- Tribunal
- Presidente del tribunal: rafael Garesse alarcón
- teresa Suarez gonzalez (vocal)
- julio Montoya villarroya (vocal)
- leandro Sastre garzon (vocal)