Tesis doctoral de Amparo Girós Pérez
Introducción la organización de las células en tejidos y órganos está mediada por la matriz extracelular (mec) y por macromoléculas de adhesión celular. Las moléculas de la mec se unen a proteínas de la superficie de las células y activan varias rutas intracelulares de señalización que regulan su supervivencia, proliferación, polaridad y diferenciación. Los componentes de estas matrices son esencialmente colágenos, glicoproteínas y proteoglicanos, cuyas características varían en cada tejido y etapa del desarrollo. El objeto de este estudio son dos de las moléculas más abundantes y ubicuas de las matrices extracelulares: el proteoglicano perlecán y la glicoproteína fibronectina. perlecán es un proteoglicano de enormes dimensiones (aprox. 400 kda), consta de 5 dominios y lleva 4 substituciones de heparán sulfato en los extremos. La proteína tiene la habilidad de unirse e interaccionar con otras proteínas de la mec (laminina, colágeno iv y fibronectina) y con moléculas de adhesión celular (como b1 y b3-integrinas, a-distroglicano). Además, mediante sus cadenas de heparán sulfato, pero también por su parte proteica, une factores de crecimiento y moléculas señalizadoras (como fgf1, fgf2, fgf7, sonic hedgehog y pdgf), estabilizándolas y facilitando su unión a receptores. otro importante componente de la mec es la fibronectina que, además de formar polímeros, también tiene la capacidad de unirse a receptores de la superficie celular (como integrinas y sindecán) y a otras proteínas de la mec como perlecán, colágeno y fibrina. La fibronectina se autoensambla cuando la proteína se une a las integrinas a través de dos sitios de unión: la secuencia arginina-glicina-aspártico (motivo rgd) y una región variable llamada modulo v. tanto perlecán como fibronectina pueden interaccionar con integrinas y de esta manera canalizar procesos señalizadores. Las integrinas pueden cambiar entre una conformación activa e inactiva. En estado inactivo, las integrinas tienen una baja afinidad por el ligando extracelular. La señalización por integrinas es particularmente compleja, ya que estas glicoproteínas que se encuentran en grandes cantidades en la superficie celular, permiten el flujo de señales de manera bidireccional. Por ejemplo, procesos de señalización intracelular, como la estimulación de la proteína quinasa c tras la señalización por factores de crecimiento, pueden activar a las integrinas. Esto resulta en un cambio conformacional que expone el sitio de unión a proteínas de la mec. Asimismo, la unión de ligandos extracelulares activa cascadas de señalización que dirigen el ensamblaje de adhesiones focales, con la consiguiente remodelación del citoesqueleto en el lugar donde se ha producido la adhesión a la mec. debido al gran entrecruzamiento de los componentes de la mec y sus abundantes modificaciones postraduccionales ha sido muy difícil el estudio de la función de estas proteínas in vivo. Las aproximaciones genéticas, mediante ratones que no expresan, total o parcialmente, la proteína, constituyen hoy en día una de las herramientas más eficaces con las que poder elucidar las complejas funciones de estas macromoléculas. el análisis del fenotipo de los ratones deficientes en perlecán, por nuestro grupo, ha demostrado el importante papel de este proteoglicano durante el desarrollo. Los embriones deficientes en perlecán muestran una severa condrodisplasia, malformaciones en el tracto de salida del corazón y una alteración en el desarrollo telencefálico. Los embriones sin perlecán mueren antes o al poco de nacer, debido a sus malformaciones cardíacas. La malformación del corazón, denominada transposición de las grandes arterias, se produce por la mayor proliferación de las células de la cresta neural que se asientan de forma anómala en los cojines miocárdicos. Por otra parte, el defecto en el cartílago, parece deberse a la incapacidad de los condriocitos para seguir un patrón de diferenciación ordenado. Tanto el control de la proliferación de las células de la cresta neural, como de la diferenciación de los condriocitos son funciones críticas en las que está implicado perlecán. por otra parte, el knockout de fibronectina demuestra la importancia de esta proteína para el correcto desarrollo del embrión. Estos embriones mueren muy tempranamente, aproximadamente a los 8.5 días de gestación, y presentan un fenotipo consistente en el eje antero-posterior acortado, debido a la falta de somitas, el corazón no se forma y está alterada la vasculogénesis del saco embrionario. tema se ha analizado la función de dos proteínas de la matriz extracelular, perlecán y fibronectina, que posiblemente juegan un papel crítico como señalizadoras celulares durante el desarrollo. El estudio lo abordamos analizando el fenotipo de ratones que tienen modificaciones en los genes que codifican para dichas proteínas. ambas proteínas están codificadas por un único gen, lo cual facilita el estudio de sus funciones a través del análisis de ratones modificados genéticamente. en el caso de perlecán se ha analizado el fenotipo del cerebro de embriones knockout (ko), donde la eliminación del exón 6 del gen conduce a la falta total de expresión de la proteína. En el cerebro, perlecán se expresa exclusivamente en las láminas basales que recubren la superficie cerebral. La ausencia de perlecán no compromete el ensamblaje de estas membranas basales. Sin embargo, perlecán sí condiciona la estabilidad de la lámina basal y su presencia es crucial para que el cerebro se desarrolle completamente. Los embriones deficientes en perlecán muestran un complejo fenotipo cerebral, consistente en atrofia, tanto de los ganglios basales como de la corteza cerebral, y en la formación de ectopias neuronales. En este trabajo se ha analizado en detalle los mecanismos moleculares y celulares que conducen a esas malformaciones. Nuestros resultados tienen particular interés, ya que los ratones deficientes en perlecán constituyen un modelo experimental de enfermedades congénitas humanas, como son la microcefalia y la lisoencefalia de tipo ii. en nuestros estudios hemos podido demostrar que la microcefalia se debe a una menor neurogénesis, debida a una alteración en la progresión del ciclo celular en los progenitores corticales. Concretamente, en la corteza cerebral, la fase g1 se alarga, sugiriendo la deficiencia de algún factor trófico neurogénico como sonic hedgehog (shh) o fgf2. En ausencia de perlecán, la atrofia cerebral sigue una secuencia basal-lateral-dorsal que concuerda bien con el patrón de distribución espacio-temporal del morfógeno shh. Este morfógeno se une a perlecán y juega un importante papel en la formación del cerebro. En los embriones deficientes en perlecán la expresión de shh está alterada, sugiriendo un papel de este proteoglicano en el control de su distribución por el cerebro. por otra parte, el estudio de las ectopias neuronales nos muestra que éstas son de aparición muy temprana, no obedecen a defectos en la migración neuronal, ni son proliferativas. Se producen en las primeras etapas del desarrollo, cuando el cerebro es un epitelio pseudoestratificado. Probablemente se forman por la aparición de pequeñas brechas en la lámina basal, debido a una mayor fragilidad de ésta en los estadios más tempranos, cuando no está protegida por las meninges. Este fenotipo nos muestra el papel de perlecán en el mantenimiento de la estructura de la lámina basal en periodos críticos del desarrollo. se ha estudiado la función de la fibronectina en ratones knockin (ki) que tienen cambiado el motivo rgd, implicado en la unión a integrinas, por un triplete rge que provoca la completa inactivación de este sitio para la adhesión celular, como demuestran muchos estudios previos. Dado que la ausencia total de fibronectina era letal en las primeras etapas del desarrollo (e8.5), se diseñó un mutante que, por una parte, fuera menos letal y por otra, permitiera conocer específicamente la función de la fibronectina como señalizadora de integrinas. Este mutante fue generado en el departamento de reinhard fí¤ssler del instituto max-planck de bioquímica de munich. Sorprendentemente la sustitución de este aminoácido también es muy letal, ya que los embriones mueren a los 10.5 días de gestación. En estos embriones estoy estudiando la función del motivo rgd durante la somitogénesis. Los embriones presentan un menor número de somitas, afectando el acortamiento a la parte posterior del embrión. También observamos que el embrión no puede completar el giro que se produce entre e8.5 y e9.0. Este giro es necesario para que el embrión adopte la posición fetal, con el cuerpo plegado por la parte ventral. En las somitas de los mutantes rge el proceso de epitelización es normal, pero en algunas ocasiones hay somitas fusionadas en las cuales no hay una definición del borde. Nuestro interés se centra en comprender los mecanismos implicados en la somitogénesis que pasan por la integración de las vías señalizadoras de integrinas, de delta/notch y posiblemente de efrinas. objetivos a) análisis del fenotipo cerebral en ratones ko de perlecán. Se utilizan cerebros de embriones deficientes en perlecán de edades entre los 12.5 y los 17.5 días de gestación. ¿ análisis de la proliferación. ¿ análisis de la apoptosis. ¿ análisis del ciclo celular de los progenitores neuronales de la corteza cerebral. ¿ señalización por shh y por fgf2. b) estudio de la somitogénesis en ki de fibronectina (motivo rge) en embriones de edades e8.5 hasta e10.5. ¿ análisis de la proliferación. ¿ análisis de la apoptosis. ¿ análisis de la polaridad de las somitas. ¿ estudio de las diferentes vías implicadas en somitogénesis, como las vías de notch, ephrinas e integrinas y las relaciones entre ellas. ¿ estudio de los defectos vasculares; análisis de las diferentes poblaciones de células endoteliales que podrían estar afectadas. bibliografía básica 1. Sm knox, jm whitelock: perlecan: how does one molecule do so many things? Cell mol life sci. 2006, 63(21):2435-45. 2. C dehay, h kennedy: cell-cycle control and cortical development. Nat rev neurosci. 2007; 8(6):438-50. 3. M costell, e gustafsson, a aszodi, m morgelin, w bloch, e hunziker, k addicks, r timpl, r fassler: perlecan maintains the integrity of cartilage and some basement membranes. J cell biol 1999, 147:1109-22. 4. T sasaki, m costell, k mann, r timpl: inhibition of glycosaminoglycan modification of perlecan domain i by site-directed mutagenesis changes protease sensitivity and laminin-1 binding activity. Febs lett 1998, 435:169-72. 5. E arikawa-hirasawa, h watanabe, h takami, jr hassell, y yamada: perlecan is essential for cartilage and cephalic development. Nat genet 1999, 23:354-8. 6. M costell, r carmona, e gustafsson, m gonzalez-iriarte, r fassler, r munoz-chapuli: hyperplastic conotruncal endocardial cushions and transposition of great arteries in perlecan-null mice. Circ res 2002, 91:158-64. 7. N kee, s sivalingam, r boonstra, jm wojtowicz: the utility of ki-67 and brdu as proliferative markers of adult neurogenesis. J neurosci methods 2002, 115:97-105. 8. C chiang, y litingtung, e lee, ke young, jl corden, h westphal, pa beachy: cyclopia and defective axial patterning in mice lacking sonic hedgehog gene function. Nature 1996, 383:407-13. 9. R dono, g texido, r dussel, h ehmke, r zeller: impaired cerebral cortex development and blood pressure regulation in fgf-2-deficient mice. Embo j 1998, 17:4213-25. 10. George, e.L., E.N. Georges-labouesse, r.S. Patel-king, h. Rayburn, and r.O. Hynes. 1993. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development. 119:1079-91. 11. T gridley: the long and short of it: somite formation in mice. Dev dyn. 2006; 235(9):2330-6. 12. Bouvard, d., C. Brakebusch, e. Gustafsson, a. Aszodi, t. Bengtsson, a. Berna, and r. Fassler. 2001. Functional consequences of integrin gene mutations in mice. Circ res. 89:211-23. 13. Pankov, r., And k.M. Yamada. 2002. Fibronectin at a glance. J cell sci. 115:3861-3. 14. Yang, j.T., H. Rayburn, and r.O. Hynes. 1993. Embryonic mesodermal defects in alpha 5 integrin-deficient mice. Development. 119:1093-105. 15. S takahashi, m leiss, m moser, t ohashi, t kitao, d heckmann, a pfeifer, h kessler, j takagi, hp erickson, r fí¤sler: the rgd motif in fibronectin is essential for development but dispensable for fibril assembly. J cell biology (en prensa). 16. A girós, j morante, c gil-sanz, a fairén, m costell: perlecan controls neurogenesis in the developing telencephalon. Bmc developmental biology 2007, 7:29.
Datos académicos de la tesis doctoral «Papel de la matriz extracelular en el desarrollo embrionario. estudio de la función de perlecan y fibronectina mediante ratones genéticamente modificados«
- Título de la tesis: Papel de la matriz extracelular en el desarrollo embrionario. estudio de la función de perlecan y fibronectina mediante ratones genéticamente modificados
- Autor: Amparo Girós Pérez
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 25/02/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Mercedes Costell Roselló
- Tribunal
- Presidente del tribunal: alfonso Fairen carrion
- reinhard Fassler (vocal)
- Fernando Martínez García (vocal)
- Juan Galcerán saez (vocal)