Tesis doctoral de Manuel Vico
La ingeniería tisular es un nuevo campo de la medicina que está centrado principalmente en la creación de tejidos artificiales para su utilización como herramientas terapéuticas. Para conseguir su objetivo la ingeniería tisular necesita una fuente adecuada de células que sean funcionales y viables, así como biomateriales y señales moleculares de distinta naturaleza. De este modo, para crear tejidos artificiales necesitamos aislar células con capacidad proliferativa, que se obtienen habitualmente de biopsias de tejido adulto o del cordón umbilical humano, siendo este último una fuente de células madre de fácil acceso y con un gran potencial de diferenciación. Las células de wharton, existentes a nivel de la gelatina de cordón umbilical, son un tipo de célula mesenquimal con potencial terapéutico que se puede inducir in vitro hacia diferentes tipos de células. en angiología y cirugía vascular la construcción de sustitutos eficientes de los vasos sanguíneos es un objetivo prioritario. En este sentido se han aplicado diferentes técnicas de ingeniería tisular, con el fin de obtener nuevos modelos de sustitutos vasculares que mejoren la calidad de los injertos, ya que uno de los factores limitantes más importantes a la hora de desarrollar un sustituto vascular mediante ingeniería tisular es el generar una superficie en la luz vascular cuya estructura sea lo más parecida posible al endotelio vascular natural y que sea capaz de ejercer las mismas funciones antitrombogénicas. Así, mediante el desarrollo de cultivos y cocultivos celulares de elementos de carácter endotelial, obtenemos células susceptibles de ser utilizadas como revestimiento de injertos artificiales. Aunque se ha demostrado que las células endoteliales son una fuente de células viables, su viabilidad sólo se mantiene en un grado aceptable en los primeros pases celulares, siendo su capacidad de proliferación por lo tanto limitada. Debido a esto, es fundamental encontrar fuentes de células para ser utilizadas en ingeniería tisular vascular con una gran capacidad de supervivencia. De este modo, se han propuesto algunas fuentes de células substitutivas del endotelio, como son la sangre del cordón umbilical y el tejido adiposo. Otra de las fuentes de células que recientemente ha despertado el interés de la comunidad científica se encuentra también en el cordón umbilical, nos referimos concretamente las células madre de la gelatina de wharton. Las características que hacen que estas células sean una fuente interesante son sus elevados niveles de proliferación en cultivo y la capacidad para diferenciarse o transdiferenciarse en un gran número de tipos celulares (potencial diferenciativo). Además, tiene las ventajas de ser una fuente que es accesible, el no ser doloroso el proceso de obtención, el ser una fuente de células autólogas y el bajo riesgo de contaminación viral. a este respecto, la presente tesis doctoral tiene por objeto obtener células endoteliales transdiferenciadas (cet) a partir de las células madre de la gelatina de wharton del cordón umbilical humano, con el fin de ser incluidas en protocolos de terapia celular. De este modo, se discute el potencial de transdiferenciación de las células de wharton del cordón umbilical humano en células endoteliales, así como se evalúa su viabilidad celular y su caracterización genética. Para ello, se describe en la introducción la histología del cordón umbilical y sus posibles usos terapéuticos, las características de la célula de wharton y los principales métodos que se utilizan para determinar la viabilidad de las células mantenidas en cultivo, incluyendo la microscopía electrónica analítica y la expresión génica celular. evaluar la viabilidad y la expresión génica de las células endoteliales transdiferenciadas a partir de células de wharton constituye el objetivo principal de la presente tesis doctoral, para lo cual se plantearon los siguientes objetivos específicos: -aislar y establecer cultivos primarios de células huvec y células de wharton del cordón umbilical humano; -determinar los patrones microanalíticos y de expresión génica de las células huvec y de wharton aisladas del cordón umbilical humano; -transdiferenciar células de wharton en células endoteliales; -determinar los patrones microanalíticos y de expresión génica de las células endoteliales transdiferenciadas; y -determinar la viabilidad celular de las células transdiferenciadas para su utilización en ingeniería tisular. por todo ello, en la presente tesis doctoral se estudia la transdiferenciación de las células de wharton hacia células endoteliales, analizando su fenotipo, su viabilidad y su actividad funcional. Para esto hemos utilizado técnicas microscópicas que nos permiten comprobar el fenotipo de las células endoteliales transdiferenciadas, microanálisis que nos permite establecer la viabilidad de dichas células, y por último, técnicas de expresión génica que nos posibilita el conocimiento de la actividad funcional de las mismas. para estudiar las células endoteliales transdiferenciadas a partir de las células madre de la gelatina de wharton, se establecieron cultivos celulares primarios y subcultivos de células madre de la gelatina de wharton y células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano (huvec) a partir cordones umbilicales obtenidos de partos por cesárea de mujeres gestantes a término, que aceptaron participar en el estudio mediante consentimiento informado. posteriormente las células madre de la gelatina de wharton se cultivaron y subcultivaron en el mismo medio que las células endoteliales para su análisis microanalítico y genético. De este modo conseguimos transdiferenciar de modo eficiente las células de wharton a células endoteliales. Con el objeto de determinar la eficacia de esta transdiferenciación, se estudió el fenotipo morfológico mediante microscopía óptica y electrónica de barrido, y el fenotipo genético, a través de la identificación de patrones de expresión génica endotelial. en primer lugar, nuestros estudios permitieron realizar una evaluación histológica tanto con microscopía óptica como con microscopía electrónica de barrido de las células de los diferentes cultivos, comprobando que la morfología de las células madre de la gelatina de wharton (morfología fusiforme o estrellada, con núcleo voluminoso y nucléolos prominentes) fue modificándose hasta alcanzar una morfología redondeada, con núcleos voluminosos y nucléolos prominentes, semejante a las células huvec. Esto demuestra que las cet adoptan una morfología similar a las células nativas endoteliales. en segundo lugar, el análisis de genes específicos de función y fenotipo endotelial demostró que varios genes y marcadores endoteliales se sobre-expresaron en las cet. Aunque no todos los genes endoteliales se sobre-expresaron en el mismo nivel que las células huvec, muchos de los mismos mostraron un claro aumento tras la inducción, sugiriendo que el proceso de transdiferenciación endotelial se había activado. Además, el análisis reveló que el incremento porcentual de la expresión génica aumentó significativamente más en algunos genes y funciones que en otros, lo que sugiere que puede existir un patrón jerárquico en el proceso de transdiferenciación hacia las células de fenotipo endotelial. por otro lado, el análisis de los genes implicados en la diferenciación celular endotelial y en el fenotipo endotelial reveló que el proceso de transdiferenciación fue eficaz desde un punto de vista estructural. De modo similar, un importante número de genes relacionados con el fenotipo y la diferenciación endotelial demostraron una sobreexpresión importante tras la inducción. además, hemos analizado la expresión de varios genes relacionados con importantes funciones endoteliales tales como la antiagregación, anticoagulación y regulación del tono vascular. En general, los resultados muestran que muchos de esos genes se sobre-expresaron tras la inducción hacia el fenotipo endotelial, pero la expresión de dichos genes alcanzó en muchos casos un nivel muy bajo comparativamente con el que expresaron las células huvec. Esto sugiere que las cet aún no son funcionales. una vez demostrada la eficacia de la transdiferenciación de las células de wharton hacia células endoteliales, se estudió la viabilidad de las mismas desde dos puntos de vista: el estudio con microanálisis y el estudio de funciones génicas asociadas, centrándonos en las funciones relacionadas con apoptosis y muerte celular. para el estudio de la viabilidad celular mediante microscopía electrónica analítica por energía dispersiva de rayos x, utilizamos células correspondientes a los tres primeros pases de cultivos celulares de las células de wharton, células huvec y cet. conocemos por estudios realizados en nuestro departamento que existen patrones iónicos específicos para las células viables, células en necrosis y células en apoptosis, siendo las concentraciones intracelulares de sodio y potasio uno de los indicadores más sensibles y fiables de viabilidad celular. Por otro lado, roomans sugiere que la razón o cociente k/na es un excelente indicador de la viabilidad celular. en este sentido, los resultados obtenidos referentes al cociente k/na de las células de wharton en los tres primeros pases fue de 2,39, de las células huvec 4,04 y el de las células endoteliales transdiferenciadas de 9,41, indicando el alto grado de viabilidad de estas últimas. el segundo método utilizado para evaluar la viabilidad de las cet en la presente tesis doctoral ha sido el estudio de la expresión génica mediante microarrays de oligonucleótido. Para ello, una vez obtenidos los genes sobre-expresados en cada tipo celular, se analizaron las funciones génicas asociadas, demostrando que los genes sobre-expresados en las células de wharton correspondieron a 134 funciones génicas sobre-representadas, de las que un 3,7% correspondieron a mecanismos de apoptosis y muerte celular. Los genes sobre-expresados en las células huvec, correspondieron a 127 funciones génicas sobre-representadas, de las cuales un 3,1% están relacionadas con apoptosis y muerte celular. Sin embargo, los genes sobre-expresados en las cet, y que correspondieron a 126 funciones génicas, no se relacionaron con ninguna función asociada a apoptosis y muerte celular. Estos resultados, que demuestran una clara disminución de funciones génicas relacionadas con apoptosis en las cet, corroboran los encontrados con microanálisis, en los que el cociente k/na indicaban una mayor viabilidad de las cet respecto a las células de wharton y a las huvec. como se indicó inicialmente, la transdiferenciación de las células de wharton en células endoteliales se analiza a través del fenotipo, de la viabilidad y a través de la actividad funcional. en lo que respecta a la evaluación de la actividad funcional de las cet, se realizadó un análisis de expresión génica en los distintos cultivos celulares utilizando microarrays de oligonucleótidos, centrando la atención en la expresión genética en cada tipo celular, lo que nos permite evaluar la citodiferenciación y la actividad celular. al analizar la expresión génica y compararla entre los distintos tipos, encontramos algunas funciones génicas sobre-representadas en las cet respecto a las células de wharton relacionadas con la presentación de antígeno, actividad del receptor mhc clase ii y procesamiento del antígeno. al comparar la expresión génica de las células de wharton respecto a las cet y obtener como resultado una sobre-expresión de genes en estas células relacionados con la presentación y procesamiento del antígeno, así como con la actividad del receptor mhc clase ii (que no se expresan en las células de wharton) se demuestra que las células endoteliales transdiferenciadas adoptan características inmunológicas típicas de la célula endotelial ortotípica. el estudio realizado permite demostrar que las células de wharton del cordón umbilical constituyen una fuente de células madre susceptibles de transdiferenciarse a células endoteliales vasculares con niveles adecuados de viabilidad y funcionalidad, aptas para su posible utilización terapéutica. los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral nos permiten establecer las siguientes conclusiones: 1. Los métodos y técnicas desarrollados y utilizados en la presente tesis doctoral permiten el aislamiento de las células madre de la gelatina de wharton del cordón umbilical humano y de las células huvec, así como su mantenimiento hasta el tercer subcultivo, sin que dicho aislamiento y mantenimiento generen alteraciones artefactuales significativas. 2. Las técnicas de microscopía electrónica analítica por energía dispersiva de rayos x utilizadas en la presente tesis doctoral nos permiten determinar la existencia de un patrón microanalítico diferenciado entre las células de wharton y las células huvec, las cuales presentan unos niveles de concentración iónica (mg, p, s, cl, k, ca) significativamente más elevados que las primeras, a excepción del sodio. 3. Las técnicas de microarray utilizadas en la presente tesis doctoral nos permiten determinar que, en relación con el patrón de expresión génica, existe un mayor número de funciones génicas vinculadas con el crecimiento y la proliferación en las células de wharton que en las células huvec, observándose en ambas un número similar de funciones génicas relacionadas con la apoptosis y la muerte celular. 4. El método descrito en la presente tesis doctoral, que tiene por base el cultivo de las células de wharton en un medio selectivo de diferenciación endotelial, permite transdiferenciar las células madre de la gelatina de wharton en células de fenotipo endotelial de acuerdo con criterios morfoestructurales, determinados mediante técnicas de microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido, y de expresión génica, determinados mediante técnicas de microarray. 5. Las técnicas de microscopía electrónica analítica por energía dispersiva de rayos x utilizadas en la presente tesis doctoral nos permiten determinar la existencia de un patrón microanalítico característico de las células endoteliales transdiferenciadas. Dichas células presentan, en comparación con las células de wharton, una disminución significativa en los niveles intracelulares de sodio y un aumento en los niveles del fósforo y del calcio y, en comparación con las células huvec, unos niveles de concentración iónica significativamente más bajos en todos los elementos analizados (na,mg, p, s, cl, k) a excepción del calcio. 6. Las técnicas de microarray utilizadas en la presente tesis doctoral nos permiten determinar que en relación con el patrón de expresión génica de las células endoteliales transdiferenciadas existe, en comparación con las células de wharton, una sobre-expresión génica de diferentes marcadores endoteliales y de diversas funciones génicas relacionadas con la respuesta inmune, concretamente con el proceso y presentación del antígeno, así como de los genes relacionados con la actividad del receptor mhc clase ii, lo que confirma la naturaleza transdiferenciada de estas células en el contexto inmunológico del organismo. La comparación de funciones génicas entre las células endoteliales transdiferenciadas y las de las células huvec muestra que no existen diferencias significativas, lo que confirma la similitud citofuncional de ambos elementos celulares. Las células endoteliales transdiferenciadas, a diferencia de las células de wharton y de las células huvec, no presentan funciones génicas relacionadas con la apoptosis ni con la muerte celular. 7. La transdiferenciación de las células madre de la gelatina de wharton a células endoteliales genera elementos celulares con alta viabilidad de acuerdo con los perfiles iónicos y de expresión génica determinados en la presente tesis doctoral, lo que convierte a dichos elementos en células potencialmente útiles en la ingeniería tisular aplicada al sistema vascular.
Datos académicos de la tesis doctoral «Evaluación de la viabilidad y caracterización genética de células endoteliales transdiferenciadas a partir de células madre de la gelatina de wharton«
- Título de la tesis: Evaluación de la viabilidad y caracterización genética de células endoteliales transdiferenciadas a partir de células madre de la gelatina de wharton
- Autor: Manuel Vico
- Universidad: Granada
- Fecha de lectura de la tesis: 19/03/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Antonio Campos Muñoz
- Tribunal
- Presidente del tribunal: ignacio Pérez de vargas ferroni
- pascual vicente Crespo ferrer (vocal)
- ricardo Fernandez valades (vocal)
- José Peña amaro (vocal)