Tesis doctoral de Ainhoa Lucía Quintana
Mycobacterium tuberculosis es la bacteria causante de una enfermedad que ha acompañado a la raza humana a lo largo de su historia y que hoy en día sigue siendo una de las enfermedades infecciosas que más muertes causa en el mundo: la tuberculosis. En el último siglo ha habido grandes avances en nuestra lucha contra ella, y contamos con la existencia de una vacuna y de varios antibióticos que hacen de ésta una enfermedad curable. debido a la propia biología de la bacteria, y en gran parte a su compleja pared celular altamente hidrofóbica, las micobacterias son intrínsecamente resistentes a una gran variedad de antibióticos. Aun así contamos con varias moléculas efectivas, pero la aparición de cepas resistentes a cada uno de los fármacos antituberculosos, así como cepas mdr (multi drug resistant) y cepas xdr (extensively drug resistant) que se han encontrado casi por todo el mundo, constituyen uno de los mayores problemas en los programas de control de la tuberculosis, ya que las posibilidades de tratar la enfermedad causada por estos bacilos se ven muy reducidas. hoy en día es urgente el desarrollo de nuevos fármacos antimicobacterianos, que sean efectivos contra las cepas resistentes. En esa dirección se está realizando en los últimos años un gran esfuerzo a nivel mundial, pero todavía es necesario un mejor conocimiento de la biología del bacilo, así como de las bases moleculares de la resistencia a fármacos. pero ¿qué se sabe de los mecanismos moleculares que causan estas resistencias? En el género mycobacterium se conocen las mutaciones más comunes que producen resistencia, que generalmente afectan a aquellos genes que codifican las dianas de estos fármacos, o a las enzimas que activan los profármacos y también se han caracterizado diversos genes implicados en resistencia. Sin embargo todavía existe un porcentaje de las cepas clínicas resistentes de las cuales se desconoce la causa de su resistencia. Conocer y comprender estos mecanismos moleculares es de gran interés para luchar contra el problema de las resistencias. por ello, el objetivo de esta tesis doctoral ha sido realizar un estudio sistemático de los mecanismos de resistencia intrínseca a antibióticos en diferentes especies micobacterianas. Nos propusimos identificar y caracterizar nuevos genes o mecanismos cuya implicación en la resistencia a fármacos aún no ha sido descrita, lo cual contribuirá a un mejor conocimiento de los mecanismos de resistencia intrínseca a antibióticos, así como a la identificación de posibles nuevas dianas para el desarrollo de fármacos antimicobacterianos. nuestra estrategia principal se ha basado en el uso de herramientas genéticas para la sobreexpresión sistemática de genes, lo cual en caso de tratarse de genes crípticos de resistencia, magnificaría el fenotipo de resistencia, haciendo más fácil la detección de dichos genes. hemos diseñado y construido un transposón (tnspaz) con un promotor micobacteriano fuerte orientado hacia el exterior, el cual además de inactivar genes por inserción, también puede sobreexpresar aquellos genes que se encuentran adyacentes a su sitio de inserción. Con él se han construido y analizado dos bancas de mutantes por transposición, una en m. Smegmatis en la cual todos los mutantes se encuentran agrupados, y otra en m. Bovis bcg, en la cual cada mutante se mantiene de manera individual. Ambas bancas han sido verificadas y posteriormente analizadas en busca de mutantes que sean resistentes a diferentes antibióticos, entre los que se encuentran los principales antituberculosos de primera y segunda línea. en la banca de m. Smegmatis, se identificaron tres mutantes resistentes a isoniazida que presentan el transposon insertado en el gen de una catalasa-peroxidasa, katg1, y que sirven como control de la funcionalidad de la banca, así como de la correcta estrategia de escrutinio. A raíz de su identificación, se ha estudiado la diferente implicación que puede tener cada una de las tres catalasa-peroxidasas que presenta m. Smegmatis en la resistencia a inh. durante la investigación de las bancas nos hemos encontrado con el problema de la aparición de mutantes espontáneos resistentes a los antibióticos sin que la inserción del transposon tuviera implicación, ya que ninguno de los genes que fueron seleccionados resultó estar implicado en la resistencia. Actualmente ambas bancas continúan siendo analizadas, y podrán ser utilizadas para cualquier estudio futuro, relacionado o no con la resistencia a los antibióticos. otra estrategia llevada a cabo para realizar nuestro estudio sistemático, ha consistido en la construcción de una librería genómica de la cepa de laboratorio m. Tuberculosis h37rv en un plásmido de sobreexpresión, con el mismo objetivo de rescatar genes crípticos de resistencia a antibióticos. Tras su construcción, verificación y amplificación esta librería se ha transformado en m. Smegmatis y m. Bovis bcg. En una primera fase del análisis se han seleccionado varios plásmidos aunque ninguno de ellos está implicado en la resistencia. Actualmente la genoteca continúa siendo analizada. si alguno de los genes que se consideren candidatos confirma su implicación en resistencia, el siguiente paso a llevar a cabo consistirá en hacer un estudio más extensivo de ese gen, incluyendo bien características enzimáticas, estudios de regulación u otros que pudieran considerarse relevantes.
Datos académicos de la tesis doctoral «Investigation of new mechanisms of intrinsic antibiotic resistance in mycobacteria«
- Título de la tesis: Investigation of new mechanisms of intrinsic antibiotic resistance in mycobacteria
- Autor: Ainhoa Lucía Quintana
- Universidad: Zaragoza
- Fecha de lectura de la tesis: 08/02/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- José Antonio Ainsa Claver
- Tribunal
- Presidente del tribunal: sofia Samper blasco
- sophie Magnet (vocal)
- María Jesús Garcia (vocal)
- esther Perez herran (vocal)