Tesis doctoral de Ileana Martínez Cabrera
El desarrollo científico alcanzado en el campo de las vacunas exige la conformación de nuevos índices de calidad en los que es necesaria la incorporación de nuevos métodos analíticos que complementen la metodología de evaluación existente. La integración de estos métodos en una metodología, los aportes que se realizan al conocimiento para el control de la vacuna antimeningocócica va-mengoc bc® (hasta el momento es la única vacuna contra el serogrupo b de neisseria meningitidis) y su aplicación integral en la evaluación de nuevas formulaciones, constituye la novedad científico-práctica del presente trabajo. el objetivo del trabajo es aplicar los métodos bioquímicos capaces de complementar la evaluación de antígenos vacunales tales como: vesículas de membrana externa (vme) de neisseria meningitidis, serogrupo b; polisacárido de neisseria meningitidis, serogrupo c (componentes de va-mengoc bc® ) y extender su aplicación al polisacárido vi de salmonella typhi, a las vme de shigella, v. Cholerae, pseudomona aeruginosa, proteínas de leptospira interrogans y antígenos lipídicos de mycobacterium tuberculosis y en vesículas de membrana externa de v. Cholerae y n. Meningitidis . la tesis consta de un diseño analítico metodológico para completar el estudio físico – químico e inmunoquímico y el control de la calidad de los dos antígenos de la vacuna antimeningocócica: 1.Vesículas de membrana externa (vme) serogrupo b, de neisseria meningitidis 2.Polisacárido serogrupo c, de neisseria meningitidis. este trabajo propone métodos que utilizan los investigadores a nivel mundial pero de forma aislada. Estos métodos fueron estandarizados y validados, posteriormente, fueron aprobados por el centro estatal de control médico y productos biológicos de cuba (cecmed), para su ejecución e incorporación en el registro médico sanitario de la vacuna antimeningocócica cubana va-mengoc bc®. 1.Vesículas de membrana externa (vme) en primer lugar, se realizó la complementación de la caracterización de las vme y se concluyó que tanto la cromatografía de tamizaje molecular como la microscopía electrónica permiten el control de la morfología vesicular. los métodos de sds-page, western blot, tipificación del lipopolisacárido, secuenciación del gen pora (que da la clasificación de la cepa a partir de la que se extrae la vme) y dot blot (para proteínas de unión a transferrina) permiten caracterizar la identidad proteica de este antígeno en diferentes etapas de su desarrollo y producción. Los resultados sugieren que los nuevos criterios propuestos para identidad y morfología vesicular pueden ser incorporados al diseño de estudios de estabilidad, conjuntamente con los análisis calorimétricos y de espectroscopia de fluorescencia. la incorporación del método de western blot para la detección de las enzimas contaminantes dnasa y rnasa resultó ser adecuada para caracterizar el parámetro de pureza y no se detectó la presencia de estos contaminantes en lotes de producción. Los patrones de caracterización físico – químico e inmunoquímico de las vme (como materia prima) se relacionaron con la inmunogenicidad cuando ya forma parte de la vacuna, determinada a través de un método elisa y con la adsorción de esta materia prima en el adyuvante hidróxido de aluminio. 2.Polisacárido c de neisseria meningitidis en segundo lugar, se completó la caracterización de este antígeno polisacarídico, demostrándose que la combinación de los métodos de tamizaje molecular, contenido de o-acetilo y viscosidad permite la determinación de la integridad molecular de esta materia prima. La aplicación de métodos de identidad como resonancia magnético nuclear (rmn) e inmunoquímicos como la aglutinación con látex, permitieron demostrar la presencia de estructuras con espectros similares a los obtenidos por instituciones internacionales de control y patrones de reconocimiento inmunoquímico específico. se realizaron los estudios de estabilidad a través de la combinación de los métodos propuestos los cuales indicaron que el polisacárido c es estable hasta 18 meses, conservado a – 20 oc después de ser purificado. El análisis del parámetro pureza permitió sugerir la incorporación del método de sds-page para la detección de lps y su posible complementación con el método de evaluación de pirógenos en conejo. 3.Otros antígenos se aplicó la metodología completa para la caracterización de polisacárido vi de salmonella typhi, antígeno que se purificó en el instituto finlay para ser formulado como vacuna antitifoidea y sustituir la vacuna de células enteras que existía hasta ese momento. Los resultados permitieron establecer el nuevo sistema de control de calidad de este antígeno, a través de una metodología similar a la aplicada en el polisacárido c. el diseño utilizado para las vme permitió comenzar la caracterización de estructuras similares purificadas a partir de shigella, v. Cholerae, pseudomona aeruginosa, a través de métodos cromatográficos, electroforéticos (incluyendo estudios preliminares de proteómica) e inmunoquímicos. en este trabajo se propone una metodología para la purificación de proteínas con funciones adhesinas a partir de leptospira interrogans, por la importancia que tienen estas proteínas en la invasión de este patógeno, lográndose purificar una proteína de unión a fibronectina de aproximadamente 40 kda y otra proteína de unión a colágeno de aproximadamente 25 kda. por último, en el marco de este trabajo se consideró conveniente incorporar a la caracterización, la identificación de los fosfolípidos presentes en las membranas externas de mycobacterium smegamatis por la posible importancia que puede significar su utilización como parte de una posible vacuna contra m. Tuberculosis y paralelamente, profundizar en la identificación de aquellos fosfolípidos que se conservan formando parte de las vme que se purifican a partir de n. Meningitidis serogrupo b y de v. Cholerae. la introducción de los métodos propuestos por la autora en el sistema de control de la calidad de vacunas producidas en al instituto finlay (cuba) y de nuevas formulaciones vacunales ha permitido perfeccionar los criterios de calidad y de caracterización de estos productos en este centro nacional de investigaciones y producción de vacunas de uso humano en cuba, con lo cual ha facilitado el perfeccionamiento de los registros médico sanitario de las vacunas, su aplicación en diferentes países y la posible introducción de los nuevos productos.
Datos académicos de la tesis doctoral «Aplicación de métodos bioquímicos a la caracterización de antígenos bacterianos de uso vacunal.«
- Título de la tesis: Aplicación de métodos bioquímicos a la caracterización de antígenos bacterianos de uso vacunal.
- Autor: Ileana Martínez Cabrera
- Universidad: Illes balears
- Fecha de lectura de la tesis: 29/01/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Christopher Jones
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Juan josé Aragón reyes
- isabel Lladó sampol (vocal)
- Marta Viana arribas (vocal)
- carmen Hermida díaz (vocal)