Tesis doctoral de Zahra Salehi Najafabadi
Resumen caracterización del gen receptor de butirolactonas de s. Tacrolimicus y su región flanqueante el genoma s. Tacrolimicus no está secuenciado, por lo que la búsqueda y clonación del gen codificante del receptor de gamma-butirolactonas en este microorganismo es una tarea compleja. El alineamiento de las regiones n-terminales conservadas de los genes de los receptores de gamma butirolactonas en 10 diferentes especies del género streptomyces presentes en las bases de datos [fara de s. Lavendulae (waki et al., 1997), sngr de s. Natalensis (lee et al., 2005), scbr de s. Coelicolor a3 (2) (takano et al., 2001), bara de s. Virginiae (okamoto et al., 1995), tara de s. Tendae (engel et al., 2001), srra de s. Rochei (arakawa et al., 2007), brp de s. Clavuligerus (santamarta et al., 2005), avar de s. Avemitilis, spbr de s. Pristinaespiralis (folcher et al., 2001), tylp de s. Fradiae (stratigopoulos et al., 2002)] permitió el diseño de cebadores degenerados para amplificar dicho gen en s. Tacrolimicus. mediante pcr utilizando los oligonucleótidos degenerados y adnt de s. Tacrolimicus como molde se amplificó un fragmento de aproximadamente 150-pb que fue clonado en el vector pgem-t easy. La secuenciación del fragmento amplificado mostró una alta similitud con fragmentos internos de genes que codifican proteínas receptoras de gamma butirolactonas. Por lo tanto, este fragmento de 150-pb fue utilizado como una sonda para el rastreo de una biblioteca génica para localizar cósmidos que contuviesen el gen gbr. Mediante este sistema de rastreo se localizaron 3 cósmidos positivos para el gen gbr, de los cuales se seleccionó el cósmido 12c1 para llevar a cabo la secuenciación del gen gbr y su región adyacente. Como resultado se obtuvo un fragmento secuenciado de 8722 pb, en el que se detectaron siete posibles marcos de lectura abierta. en el análisis de orfs se detectaron: i) un regulador de la transcripción de la familia tetr con un 78% de identidad con un regulador transcripcional tetr de streptomyce griseus; ii) dos subunidades de dihidroxiacetona quinasas, la subunidad 1 con un 84% de identidad y la subunidad 2 con un 75% de identidad con las mismas proteínas de s. Griseus; iii) una hidrolasa con el 76% de identidad con una hipotética hidrolasa en s. Griseus; iv) el gen gbr que posee un 66% de identidad con el receptor butirolactonas (mmfr) de s. Coelicolor a3 (2); v) una glutamina sintetasa con el 98% de similitud con la glutamina sintetasa de streptomyces sp. Spb74; vi) y una proteína de membrana con 82% de identidad con s. Pristiaespiralis atcc 25486. control del gen gbr mediante secuencias are el gen gbr presenta una longitud de 645-pb y codifica una proteína de 214 aminoácidos (23,4 kda). El alineamiento de la proteína gbr con otros receptores gamma butirolactonas [incluida la proteína cprb de s. Coelicolor a3(2) cuya estructura cristalina ha sido determinada), mostraron una similitud significativa entre ellas, especialmente en los residuos de las hélices ¿3 (segunda hélice de una típica hélice-vuelta-hélice) del dominio de unión adn. Además, el aminoácido trp131 también está bien conservado en la proteína gbr, que es esencial para la actividad de unión al ligando . para demostrar la actividad autorreguladora de la proteína gbr sobre su propia expresión, la proteína gbr se sobre expresó y purificó como una proteína de fusión (gst gbr). En este proceso, diferentes modificaciones fueron probadas para obtener la proteína pura, dentro de las cuales las mejores condiciones observadas fueron: i) 4 g/l de lb (dilución del medio estándar); ii) 22 °c; iii) 0,3 mm de concentración final de iptg; iv) 3-4 horas de cultivo. La proteína de fusión expresada se purificó a partir del extracto celular crudo por cromatografía de afinidad con glutatión sefarosa utilizando un akta fplc (fast protein liquid chromatography) y una columna de 1 ml (gstraptm hp). la región promotora del gen gbr presenta una secuencia conservada are localizada 338 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio de la traducción. Fragmentos de diferentes tamaños de la región promotora se utilizaron para acotar el motivo are mediante ensayos de retraso en gel (emsa). Así, el fragmento gbre-5 (36 nt) permitió definir la secuencia aaacatcacgacgactacgttatttt como una secuencia are. efecto del gen gbr en la diferenciación morfológica y en la producción de metabolitos secundarios con objeto de determinar la función in vivo del gen gbr en s. Tacrolimicus se llevó a cabo la deleción de dicho gen mediante la tecnología redirect. La secuencia de 8722 pb, que se describe en la sección anterior, garantiza que el cósmido 12c1 posee suficiente espacio a ambos lados del gen gbr para realizar el proceso de deleción (doble recombinación homóloga). De acuerdo a esta metodología se realizó la sustitución del gen gbr por el gen de resistencia a apramicina y el origen de transferencia (orit) en el cósmido. Posteriormente el proceso de conjugación se llevó a cabo en base a lo descrito por flett y colaboradores (1997). La complementación y la duplicación del gen gbr se realizó utilizando el vector conjugativo integrativo pra neo. a pesar de haber sido descrito con anterioridad que s. Tacrolimicus es una cepa productora de tacrolimus (garrity et al., 1993; yoon y choi y et al., 1997; jung et al., 2009), utilizando el análisis por hplc, no ha sido posible obtener un pico cromatográfico correspondiente a tacrolimus. Por lo que se realizaron bioensayos utilizando la cepa s. Cerevisiae tb23 [sensible a inmunosupresores (arndt et al., 1999)] con caldos de fermentación concentrados de diferentes cepas de s. Tacrolimicus, en medio de r5. De esta manera se pudieron observar claros halos de inhibición que demostraron la producción de un compuesto con actividad inmunosupresora similar a tacrolimus en s. Tacrolimicus. Mediante el análisis por bioensayo se pudo comprobar que la cepa delecionada en el gen gbr produce mayor cantidad del posible compuesto inmunosupresor comparada con la cepa silvestre. Así mismo la cepa complementada presentó una producción de dicho compuesto menor que la cepa mutante (similar a la silvestre). Por ello, se puede concluir que el gen gbr actúa como un inhibidor de la producción de metabolitos secundarios similares a tacrolimus. con el objeto de estudiar el efecto del gen gbr en la diferenciación morfológica de s. Tacrolimicus, se analizaron las características fenotípicas de las cepas: silvestre, ¿gbr, duplicada y complementa en medio sólido. Las cepas silvestre y duplicada cultivadas en medio r5 presentaron serias dificultades en la producción de esporas. Por su parte, la cepa mutante ¿gbr mostró una buena esporulación. Estas diferencias en la esporulación se observaron también en el medio de tbo. En este medio, el inicio de la esporulación de la cepa ¿gbr fue por lo menos un día anterior y la cantidad de esporas fue más abundante que en la cepa silvestre. Con respecto a la cepa duplicar la eficiencia de esporulación fue muy baja. Todos estos cambios en los fenotipos de la cepa mutante ¿gbr fueron restaurados por la introducción de una copia del gen gbr intacta. caracterización de los plásmidos presentes en s. Tsukubaensis en contra de lo que suele ocurrir en la mayoría de eubacterias, la mayoría de los plásmidos y cromosomas presentes en especies del género streptomyces suelen ser lineales (hayakawa et al., 1979; lin et al., 1993), llegando incluso a albergar hasta tres o cuatro plásmidos lineales (kinashi et al., 1994; zhang et al., 2006). el análisis del genoma de s. Tsukubaensis mediante geles en campo pulsante (pfge: pulse field gel electrophoresis) en las condiciones optimizadas (0,8% de agarosa, tampón tbe 0,5x, 150 v durante 24 horas con tiempo de pulso 120 segundos y 36 horas con 240 segundos) mostró que hay dos plásmidos lineares gigantes psts-l (1,8 mb) y psts-m (0,9 mb) y un plásmido circular psts-s. Estos plásmidos circulares presentan problemas de estimación de su tamaño, ya que no migran de acuerdo a éste, migrando casi como en la electroforesis tradicional (kieser et al., 2000). Por ello, mediante el método de lisis alcalina, dos plásmidos circulares, denominados psts1 y psts2 se extrajeron de s. Tsukubaensis. Los cuales posteriormente fueron localizados en el genoma de s. Tsukubaensis, presentando unos tamaños de 24.747 pb y 31.070 pb, respectivamente. Lo cual indicó que el plásmido psts-s son en realidad 2 plásmidos circulares de pequeño tamaño. caracterización del gen del receptor de -butirolactona de s. Tsukubaensis el microorganismo s. Tsukubaensis es un productor conocido de tacrolimus del cual se está llevando a cabo la secuenciación de su genoma en inbiotec. Dicho genoma reveló muchos genes reguladores de biosíntesis, entre los cuales se ha localizado un grupo de 11 posible genes reguladores [designado como agrupación tsu (por s. Tsukubaensis)], el cual presenta gran similitud con la agrupación de genes de gamma butirolactonas en s. Rochei (arakawa et al., 2007). entre los genes que aparecen en esta región detectaron: i) dos receptores gamma butirolactonas homólogos denominados tsur1 (75% de identidad con el receptor alpz de s. Ambofaciens) y tsur2 (52% de identidad con el receptor srrb s. Rochei), ii) dos gamma butirolactonas sintetasas denominadas tsus1 (47% de identidad con la gamma butirolactona sintetasa barx de streptomyces sp. Mg1) y tsus2 (44% de identidad con la gamma butirolactona sintetasa farx de s. Lavendulae); iii) dos reguladores de la familia sarp (streptomyces antibiotic regulatory proteins) tsuy (77% de identidad con el regulador de la familia sarp, srry, de s. Rochei) y tsuz (78% de identidad con el regulador de la familia sarp, srrz, de s. Rochei). la presencia de más de un receptor de gamma-butirolactonas, gamma-butirolactona sintetasas y genes de la familia de reguladores sarp en streptomyces no es extraño. Así, s. Rochei posee tres genes receptores de gamma-butirolactona (srra, srrb y srrc) y dos regulador de la familia sarp (srry y srrz) (arakawa et al., 2007). S. Scabies y s. Virginiae poseen dos genes de receptores para gamma-butirolactona y dos genes codificantes de gamma butirolactonas sintetasas (kitani et al., 2008a; kinoshita et al., 1997). S. Fradiae también presenta dos genes para receptores de gamma butirolactonas (stratigopoulos et al., 2002). En todos los streptomyces que presentan más de un gen para receptores de gamma-butirolactona agrupados sólo uno de ellos es el receptor de gamma butirolactonas real (arakawa et al., 2007). el gen tsur1 es el receptor real butirolactonas en s. Tsukubaensis los receptores de gamma-butirolactona y sus homólogos pueden ser clasificados en dos grupos: i) un grupo de receptores autoregulatodos reales cuya unión se verifica bioquímicamente: ii) y un grupo de pseudo-receptores, que parecen no tener clara actividad de unión (kitani et al., 2008a; matsuno et al., 2004). Los dos grupos se pueden diferenciar por los valores de pi de la proteína, ya que los receptores reales presentan valores ácidos, mientras que los pseudo-receptores muestran valores muy básicos. el gen tsur1 codifica la proteína de 225 aminoácidos con un peso molecular de 24 kda y un pi de 5,51. Mientras que la proteína tsur2 posee 212 aminoácidos, un peso molecular de 21,9 kda y un pi de 10,15. Ambas proteínas tsur1 y tsur2 presentan el aminoácido triptófano (w) en la hélice ¿7, que se conserva bien entre los autoreguladores de este tipo y es considerado como un residuo importante para la formación lugares de unión (natsume et al., 2004). la proteína tsur1 presenta una función autorreguladora para el análisis de la función autorreguladora de las proteínas tsur1 y tsur2 se realizaron ensayos de emsa y de protección de adn frente a adnasa i (footprinting). Estas proteínas, al contrario de la proteína gbr, son muy estables y no pierden su actividad con el tiempo lo que permitió hacer estos ensayos. Así, una secuencia protegida fue identificada en la región intergénica tsur1 tsuwk, la cual mediante el análisis de footprinting con la proteína tsur1 se identificó como aaaatacggactacctggtttggttctg (posición -56, respecto al inicio de transcripción). Dicha secuencia es bastante similar a la secuencia consenso are. Este resultado demuestra que la proteína tsur1 tiene actividad de autorregulación. en cuanto a la proteína tsur2, se identificó una secuencia protegida en la región intergénica tsur2-tsus2. Mediante el análisis de footprinting se caracterizó la secuencia como: tcttaacaaaccgcttggacggtttata (posición: -331) presentando una alta similitud a la secuencia consenso are. la comparación con los receptores gamma-butirolactonas en otros streptomyces (arakawa et al., 2007; kitani et al., 2008a; kinoshita et al., 1997) y la caracterización molecular de las proteínas tsur1 y tsur2 nos permite confirmar que tsur1 es el receptor real de butirolactonas en s. Tsukubaensis y tsur2 es un posible pseudo-receptor. el receptor de butirolactonas tsur1 regula la expresión del un regulador de la familia sarp tsuy numerosos reguladores de la familia sarp se han caracterizado conjuntamente con agrupaciones de genes de biosíntesis de antibióticos o reguladores de su producción, ya que suelen albergar al menos un gen que codifica para una proteína sarp (aigle et al., 2005; wietzorrek y bibb, 1997). Algunas agrupaciones, sin embargo, poseen más de un gen codificante de proteínas sarp, como los genes de biosíntesis de pristinamicina en s. Pristinaespiralis (folcher et al., 2001), la agrupación de genes reguladores de lankacidina y lankamicina en s. Rochei (mochizuki et al., 2003), los genes de la biosíntesis de aclacinomicina en s. Galilaeus (raty et al., 2002) la agrupación de genes de la biosíntesis de tilosina en s. Fradiae (bate et al., 1999). los reguladores sarp reconocer repeticiones heptaméricas directas en las cajas 35 de los promotores de los genes regulados (arias et al., 1999; sheldon et al., 2002; garg y parry, 2010). Después de unirse a estas repeticiones directas específicas, los reguladores sarp facilitan la unión de la arn polimerasa al inicio de la transcripción de los genes (takana et al., 2007). La familia de genes reguladores sarp suelen ser dianas de los receptores de gamma-butirolactona (folcher et al., 2001; takano et al., 2005), excepto en el caso de arpa, cuya diana es el gen adpa, un gen regulador transcripcional de la familia arac. ensayos de protección demostraron que la proteína tsur1 se une específicamente a una gran secuencia de la región promotora del gen tsuy, la cual contiene dos cajas de are (una en la cadena codificante y el otra en la cadena complementaria. En s. Fradiae, el receptor de butirolactona tylp reprime la expresión del gen sarp tyls (bignell et al., 2007; stratigopoulos et al., 2002), lo que resulta en la represión de tylr, un gen que codifica un activador específico en la biosíntesis de tilosina (stratigopoulos et al., 2004). En s. Pristinaespiralis, spbr se une a promotor del gen papr1 (sarp), y regula la síntesis de pristinamicina (folcher et al., 2001). la proteína tsuy contienen un dominio regulador transcripcional (trans_reg_c) en n-terminal, y un dominio activador transcripcional bacteriano (btad) en el extremo c-terminal característico de reguladores sarp al igual que sucede en la proteína tsuz de la agrupación tsu. s. Tsukubaensis presenta dos genes codificantes de butirolactonas sintetasas los receptores de butirolactonas suelen ocupar un alto nivel en la cascada de regulación específica de vía para la regulación de la síntesis de antibióticos. Por ello, las butirolactonas sintetasas también poseen una función importante en esta cascada. De forma similar a lo que sucede en el sistema afsa-arpa, sistemas similares de butirolactonas se han encontrado en otros estreptomicetos, por ejemplo, el sistema de barx-bara en s. Virginiae (kawachi et al., 2000), farx-fara en s. Lavendulae (kitani et al., 2001), scba-scbr en s. Coelicolor a3(2) (takano et al., 2001) y srrx-srra en s. Rochei (arakawa et al., 2007). Sin embargo, sus efectos en la producción de antibióticos y diferenciación morfológica son dependientes de especie. hay dos hipotéticas butirolactonas sintetasas (tsus1 y tsus2) en la agrupación génica tsu en s. Tsukubaensis. Estas proteínas tsus1 y tsus2 poseen dos dominios pfam03756 en sus extremos n- y c-terminales. Casi todas las proteínas que presentan un dominio pfam03756 presentes en las bases de datos son homólogos de la proteína afsa de streptomyces (kato et al., 2007). El análisis mediante emsa mostró que tsur1 se une a las regiones promotoras de los genes tsus1 y tsus2 reprimiendo posiblemente su transcripción. La represión de las butirolactonas sintetasa por un receptor de butirolactonas ha sido descrita recientemente en s. Coelicolor (mehra et al., 2008). citocromo p450: objetivo de tsur el gen tsub, que codifica un citocromo p450, es una de las dianas de tsur1 como se ha visto por emsa y ensayos de protección. Este gen posee un codón tta en los nucleótidos 73 a 75, el cual es reconocido por blda (trnaleu) en diferentes streptomyces (tao et al., 2007; takano et al., 2003). Este codón no ha sido localizado en los otros genes de la agrupación reguladora tsu. El gen ortólogo tsub en s. Fradiae (orf16, que participa en la biosíntesis de butirolactona), así como tylp (receptor de butirolactona), tyls y tylt (reguladores sarp) y tylr contienen un solo codón tta (bingnel et al., 2007; bate et al., 1999). En s. Coelicolor el gen blda se expresa predominantemente en la fase estacionaria tardía (leskiw et al., 1993) y es necesario para la traducción de los codones de leucina escasos en proteínas reguladoras específicas de vía que están involucradas en la diferenciación de la colonia, la formación de micelio aéreo y la producción de antibióticos (chater y chandra, 2008; white y bibb, 1997; guthrie et al., 1998). genes controlados por el pseudo receptor de butirolactonas tsur2 curiosamente, la proteína tsur2, que es una proteína de la familia tetr y un posible pseudo receptor de butirolactona en s. Tsukubaensis, se une a las mismas regiones promotoras que tsur1 proteína. Las proteínas de la familia tetr contiene dos dominios funcionales de forma independiente, un dominio de unión al adn y un dominio regulador (ramos et al., 2005). Recientemente se ha descrito que los pseudo receptores de butirolactonas también desempeñan una función específica en la biosíntesis de antibióticos al unirse y responder a señales de los antibióticos usando sus dominios reguladores (novakova et al., 2010; xu et al., 2010). En s. Aureofaciens el regulador aur1r (un homólogo de tsur2) específicamente reprime la expresión del gen aur1p, que codifica un activador específico de ruta del grupo de genes de biosíntesis auricina. Pero esta represión se libera con auricina o sus intermediarios (novakova et al., 2010). la función de unión a los antibióticos de los pseudo receptores de butirolactonas también se ha descrito sobre las proteínas scbr2 y jadr2 (xu et al., 2010). La proteína scbr2 de s. Coelicolor puede unirse a los antibióticos endógenos actinorodina y undecilprodigiosina como ligandos, que conducen a la des represión de kaso, un activador de una agrupación críptica de policétido sintasas tipo i. Al igual que scbr2, jadr2 de s. Venezuelae también puede unirse a los antibióticos cloranfenicol y jadomicina, cuyas interacciones conducen a la des represión de jadr1, que activa la biosíntesis de jadomicina mientras reprime directamente la biosíntesis cloranfenicol. existen diferentes policétido sintetasas (como tsua) situadas alrededor de la agrupación reguladora tsu que podrían estar involucradas en la producción de algunos policétidos no identificados diferentes del tacrolimus. Sin embargo, el orden jerárquico de estos genes (y tal vez otros) en la cascada de regulación que controla la producción de tacrolimus u otro metabolito policétido debe establecerse. efecto de la deleción de los genes de la agrupación tsu sobre la producción de tacrolimus en s. Tsukubaensis existen varios estudios de mutagénesis de los receptores de gamma-butirolactonas. En su mayoría, la eliminación del receptor afecta (positiva o negativamente) a la producción de antibióticos y rara vez sucede que no tenga ningún efecto sobre la producción. Así, la supresión de fara en s. Lavendulae (kitani et al., 2001), brp en s. Clavuligerus (santamarta et al., 2005), tylp en s. Fradiae (bate et al., 1999) y sngr en s. Natalensis (lee et al., 2005) mejoran la producción de antibióticos. en cuanto a s. Tsukubaensis la producción de tacrolimus se redujo drásticamente en las cepas mutantes ¿tsur1, mientras que la deleción de gene tsur2 no mostró ningún efecto detectable sobre la producción de tacrolimus. Esta carencia de efecto sobre la producción abunda en la idea de que el gen tsur2 en un pseudo-receptor. además, el mutante ¿tsur1 produjo un pigmento de color rosa en el medio de fermentación el cual no está presente en la cepa silvestre y ni en la cepa mutante ¿tsur2. Esta producción de pigmentos en el medio por parte del mutante ¿tsur1 se inició después de 3 días de cultivo lo que sugiere que la proteína tsur1 actúa como un regulador negativo en la biosíntesis de este compuesto. la supresión de genes de las butirolactonas sintetasas tsus1 y tsus2 disminuyó ligeramente la producción de tacrolimus en los mutantes. Mientras que la deleción de los genes tsuy o tsuz no mostraron ningún efecto aparente en la producción de tacrolimus. efectos fenotípicos de la deleción de los diferentes genes de la agrupación tsu el efecto fenotípico de la mutación en los distintos genes de la agrupación tsu se analizó por comparación de los diferentes mutantes (¿tsur1, ¿tsur2, ¿tsus1, ¿tsus1, ¿tsuy y ¿tsuz) con la cepa silvestre en medio sólido isp4. Así, la morfología de cada mutante fuer fotografiada después de 7 días de crecimiento a 28 °c y las mismas colonias fueron utilizadas para analizar la esporulación. la morfología de las colonias mutantes fue muy diferente en comparación con la cepa silvestre de s. Tsukubaensis. La cepa ¿tsur1 forma pequeñas colonias, que son de color amarillo en el centro (micelio aéreo sin esporulación) y las esporas de color gris alrededor de la colonia. Mientras que el mutante ¿tsur2 presenta grandes colonias, que están totalmente esporuladas. Por lo tanto el gen tsur2 tiene un efecto negativo sobre la esporulación. Las colonias relacionadas con los mutantes ¿tsus1 y ¿tsus2 son más pequeñas que la cepa silvestre y presentan un hundimiento en el centro y una capa de esporas alrededor de la colonia. Estos mutantes forman colonias irregulares. Las colonias ¿tsuy y ¿tsuz son grandes, amarillas, con micelio aéreo voluminoso en el centro y las esporas alrededor de las colonias. Las colonias del mutante ¿tsuz poseen un mayor número de esporas de color gris en comparación con las colonias ¿tsuy. en cuanto al inicio de la esporulación en medio isp4, la cepa ¿tsur1 presentó esporas al menos 1 día más tarde que las otras cepas, aunque después de 7 días estaba totalmente esporulada. La cepa ¿tsuz presentaba micelio aéreo de color blanco hasta los 5 días, tras lo cual cambió a color gris (esporas). En cuanto a la cepa ¿tsuy, incluso después de 7 días todavía aparecía micelio aéreo blanco en el centro y las esporas sólo eran visibles en el borde del cultivo. Las esporas de las cepas mutantes ¿tsur1, ¿tsur2 y ¿tsus2 eran más oscuras que la cepa silvestre, mientras que la cepa ¿tsur2 presentaba una mejor esporulación que la cepa silvestre. optimización de medio de producción de tacrolimus en s. Tsukubaensis la composición los medios de cultivo suele presentar una relación directa con la biosíntesis de antibióticos (elibol y mavituna, 1998; elibol, 2004). Por ello, el control de la regulación del metabolismo a través de diversos elementos como fuetes de carbono, nitrógeno, aminoácidos o elementos minerales es un punto interesante para incrementar la producción de metabolitos secundarios en los microorganismos (gesheva et al., 2005; kim y park, 2008; singh y behera, 2009). diferentes estrategias se pueden utilizar para la optimización de las condiciones de cultivo y producción (mao et al., 2007; farid et al., 2000). En este estudio se fueron optimizando factores de manera individual analizando la producción final de tacrolimus. Así, todas las fermentaciones se realizaron por triplicado en matraces lisos de 500 ml con 100 ml de medio líquido isp4, incubación a 28 °c y agitación orbital de 220 rpm. Las condiciones seleccionadas se acumularon para el siguiente paso de optimización. La fuente de carbono metabolizable de forma rápida (glucosa) y sostenible (metabolismo lento: dextrina de maíz)], el agente tamponante y el ph del medio se constataron como factores clave en la producción de tacrolimus. Por lo tanto, se ha desarrollado un medio químicamente definido para s. Tsukubaensis, que es adecuado para el estudio de la regulación del metabolismo de la síntesis de tacrolimus. El medio final optimizado, denominado medio isp-z, posee la siguiente composición, con un ph ajustado a 6,5: con las condiciones descritas anteriormente la producción de tacrolimus comenzó a las 20 horas del inoculo inicial y el título volumétrico de tacrolimus en este medio fue de 90 mg/ml con la máxima producción específica de 14,88 1,8 mg/mg.
Datos académicos de la tesis doctoral «Caracterización de los receptores de gamma butirolactonas en las especies productoras de tacrolimus streptomyces tacrolimicus y streptomyces tsukubaensis. análisis de sus sistemas de auto-regulación«
- Título de la tesis: Caracterización de los receptores de gamma butirolactonas en las especies productoras de tacrolimus streptomyces tacrolimicus y streptomyces tsukubaensis. análisis de sus sistemas de auto-regulación
- Autor: Zahra Salehi Najafabadi
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 17/12/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Carlos Barreiro Méndez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: paloma Liras padín
- Marta Rodríguez sáiz (vocal)
- Juan Soliveri de carranza (vocal)
- Alberto Sola landa (vocal)
