Tesis doctoral de Damian Gonzalez Mellado
La síntesis de ácidos grasos es un proceso omnipresente en todos los organismos, ya que éstos forman parte esencial de la estructura de los seres vivos. La base fundamental de esta ruta es la agregación de moléculas cortas de hidrocarburos para generar una molécula de mayor longitud. Este proceso se realiza en múltiples pasos con la participación de varias enzimas. El primer paso consiste en la generación de malonil-coa, molécula corta de 3 carbonos, a partir de acetil-coa mediante la actividad de las enzimas acetil-coa carboxilasa (accasa) (e.C. 6.4.1.2) y el malonil-acp generado a partir del malonil-coa por la malonil-coa:acp transacilasa (mcat) (e.C. 2.3.1.39). El malonil-acp generado junto con acetil-coa son utilizados por el complejo ácido graso sintasa (fas, fatty acid syntase), que realiza la elongación desde 2 hasta 16 átomos de carbono. Este complejo se compone de cuatro actividades enzimáticas diferentes: íY-cetoacil-acp sintetasas (kas) (e.C. 2.3.1.41), íY-cetoacil-acp reductasas (e.C. 1.3.1.9), íY-hidroxiacil-acp dehidratasa (e.C. 4.2.1.54-61) y enoil-acp reductasa (e.C. 1.3.1.9). durante el desarrollo de esta tesis, se han clonado, a partir de semillas en desarrollo de girasol, y secuenciado el cdna hakasiii, codificante de la actividad íY-cetoacil-acp sintasa iii. Este gen se encuentra como copia única en el genoma del girasol y se expresa en todos los tejidos estudiados aunque su expresión es mayor durante el desarrollo de las semillas, coincidiendo con la síntesis activa de lípidos de reserva. La expresión heteróloga de hakasiii en e. Coli alteró el contenido y composición de ácidos grasos, implicando la interacción de hakas iii con el complejo fas bacteriano. La caracterización in vitro de la proteína recombinante purificada utilizando un sistema fas bacteriano reconstituido, carente de actividad condensante, mostró la síntesis de acil-acps que abarcaban de 4 a 10 átomos de carbono, no limitando su actividad al primer paso de síntesis de ácidos grasos tal y como se había mostrado anteriormente en otras kasiii de plantas. igualmente, se ha clonado y secuenciado el cdna hakasii, codificante de la actividad íY-cetoacil-acp sintasa ii en el girasol. Este gen, al igual que hakasiii, se encuentra como copia única en el genoma del girasol y se expresa de forma constitutiva y niveles similares en todos los tejidos estudiados. La obtención de proteína recombinante soluble mediante expresión heteróloga en e. Coli resultó infructuosa, encontrándose formando parte de cuerpos de inclusión, tal y como había sucedido con otras kasii de plantas estudiadas anteriormente. asimismo, a partir de semillas en desarrollo de girasol se ha clonado y secuenciado el cdna de hakasi, que codifica para la actividad íY-cetoacil-acp sintasa i. Este gen, al igual que los anteriores, se encuentra como copia única en el genoma del girasol y se expresa de forma constitutiva y niveles similares en todos los tejidos estudiados. De igual forma que en el caso de la proteína hakasii, la obtención de proteína recombinante hakasi soluble mediante expresión heteróloga en e. Coli resultó infructuosa, encontrándose formando parte de cuerpos de inclusión. El estudio funcional in vivo de hakasi mediante su introducción por recombinación en e. Coli bajo el control del promotor del gen fabf en un contexto génico donde se deleccionaron los genes fabf y/o fabh por recombinación puso de manifiesto la interacción de esta proteína con el sistema de síntesis de ácidos grasos de la bacteria produciendo una drástica reducción de la tasa de crecimiento de la estirpe que sólo poseía los genes hakas i y ecfabb como únicas proteínas condensantes, así como la modificación de la composición de ácidos grasos. utilizando la información disponible del genoma de ricinus communis l., Se han aislado los tres genes responsables de las actividades íY-cetoacil-acp sintasa i, ii y iii (rckasi, rckasii y rckasiii, respectivamente) para futuros estudios. Al igual que en el caso de los genes kas de girasol sólo presentan una copia en el genoma y el análisis de expresión de estos mostró una expresión constitutiva en todos los tejidos, apreciándose un punto máximo de expresión en semillas para los tres genes estudiados en el estadío 5 de maduración, y en rckas i y rckas iii un incremento acusado en la raíz de las plántulas analizadas. La expresión heteróloga de rckas iii en e. Coli alteró tanto la cantidad como la composición de ácidos grasos indicando la funcionalidad e interacción de dicho gen con el complejo fas bacteriano. el estudio filogenético de proteínas kass mostró dos orígenes filogenéticos distintos. Por un lado, las proteínas kasiii comparten ancestros con el grupo de las cianobacterias, indicando su origen endosimbiótico. Mientras que las proteínas kasi y kasii muestran un origen filogenético bacteriano no teniendo homologos entre las cianobacterias, apuntando a su presencia en la célula hospedadora donde se produjo la endosimbiosis y adquisición de cloroplastos. una vez sintetizados los ácidos grasos en el interior del plastidio/cloroplasto pasan a formar parte del pool citoplasmático de acil-coas pudiendo sufrir posteriores modificaciones. Una de estas es la elongación por parte de un comlejo análogo a fas, el complejo fae (fatty acid elongase). A partir de semillas en desarrollo de girasol se ha clonado y secuenciado dos cdnas, hakcs1 y hakcs2, que codifican para la actividad íY-cetoacil-coa sintasa. Estos genes se encuentran como copia única en el genoma del girasol y el análisis de expresión mostró niveles más altos para hakcs1 en tallo y para hakcs2 en raíz, mostrando ambos en semilla un incremento de expresión conforme avanzaba la maduración de esta. La caracterización funcional mediante la expresión heteróloga de los genes hakcs1 y hakcs2 en levaduras modificó tanto la cantidad como la composición de ácidos grasos largos de estas. La complementación de un mutante carente de actividad elongasa de ácidos grasos de cadena larga confirmó en ambos genes su capacidad condensante.
Datos académicos de la tesis doctoral «Identificación y caracterización de los genes responsables de la actividad b-cetoacil-acp sintasa de girasol (helianthus annuus l.) y ricino (ricinus communis l.), e identificación y caracterización de los genes responsables de la actividad b-cetoacil-coa sintasa en las semillas en desarrollo de girasol«
- Título de la tesis: Identificación y caracterización de los genes responsables de la actividad b-cetoacil-acp sintasa de girasol (helianthus annuus l.) y ricino (ricinus communis l.), e identificación y caracterización de los genes responsables de la actividad b-cetoacil-coa sintasa en las semillas en desarrollo de girasol
- Autor: Damian Gonzalez Mellado
- Universidad: Sevilla
- Fecha de lectura de la tesis: 05/02/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Enrique Martinez Force
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Francisco javier Florencio bellido
- Ana gracia Pérez rubio (vocal)
- eduardo Santero santurino (vocal)
- Francisco Javier Cejudo fernández (vocal)
