Tesis doctoral de Raquel Navarro Sempere
El virus del mosaico del pepino dulce (pepino mosaic virus, pepmv; género potexvirus) es un virus de rna de sentido positivo que causa importantes pérdidas económicas en cultivos de tomate de europa y américa del norte. En el presente trabajo se ha llevado a cabo una búsqueda de fuentes de resistencia natural a pepmv mediante el escrutinio de germoplasma de especies afines al tomate pertenecientes al género solanum. Este estudio ha puesto de manifiesto que las fuentes de resistencia a este virus son muy escasas. De todas las entradas de solanum analizadas en este trabajo, no se encontró ningún caso de resistencia completa a pepmv. Tan sólo la entrada com-2 perteneciente a la especie s. Corneliomuelleri mostró una respuesta heterogénea a la infección por pepmv (aislado sp13). Los resultados obtenidos tras el análisis de la descendencia obtenida a partir de esta entrada sugieren que en la entrada com-2 existan varios genes con relativamente pequeños efectos aditivos sobre la resistencia a pepmv-sp13, es decir, que se trate de una resistencia poligénica o cuantitativa. por otra parte, en el presente trabajo se ha pretendido profundizar en el conocimiento de la biología molecular de pepmv para llevar a cabo el desarrollo de un vector viral de expresión derivado de este virus. Como paso previo y necesario, se ha obtenido un clon agroinfectivo de pepmv (aislado pepmv-sp13), denominado pbpepxl6. Tras agroinfiltración, pbpepxl6 es capaz de reproducir la misma sintomatología que el virus parental tras la inoculación mecánica sobre plantas de nicotiana benthamiana. Este clon agroinfectivo constituye una herramienta molecular indispensable que ha permitido realizar un análisis funcional de la proteína de la cápsida (cp). Así, mediante técnicas de mutagénesis dirigida sobre el clon pbpepxl6, se han obtenido mutantes que impiden la expresión de la cp. En uno de ellos, denominado pbpepgfpdeltacp1, se ha sustituido el orf de la cp por el orf del gen delator de la proteína verde fluorescente (gfp), de modo que los focos de infección iniciados pudieron ser visualizados mediante la detección de la fluorescencia generada por la gfp. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que (1) la cp no es necesaria para la multiplicación de pepmv pero sí para su movimiento célula a célula, (2) es posible expresar un gen foráneo (gfp) a partir del genoma de pepmv, condición fundamental para el desarrollo de un vector viral y (3) el número de focos iniciales de infección a que da lugar la agroinfiltración de clones derivados de pepmv es pequeño. Adicionalmente, se generaron construcciones basadas en pbpepgfpdeltacp1 a las que se les introdujo diferentes tipos de mutaciones en las regiones 5prima y 3prima terminales del orf de la gfp. Los ensayos de agroinfiltración llevados a cabo con estas construcciones mostraron que la alteración de dichas regiones puede afectar negativamente a la eficiencia de un potencial vector viral. Para el desarrollo de un vector viral, se generaron dos construcciones derivadas de pepmv (pbpep501 y pbpep5.128) en las que el orf de la gfp fue situado bajo el control del promotor del rna subgenómico de la cp duplicado. Los ensayos de agroinfiltración llevados a cabo con ambas construcciones mostraron la capacidad de estos vectores para expresar gfp e infectar sistémicamente plantas de n. Benthamiana. Sin embargo, se observó que las construcciones eran inestables in planta, pues la fluorescencia decaía drásticamente a pocos días post-infiltración, probablemente debido a fenómenos de recombinación homóloga. Por otro lado, estos resultados permitieron delimitar una región en el genoma de pepmv que contiene todos los elementos funcionales (que actúan en cis) necesarios para actuar como promotora del rna subgenómico de la cp. Esta región posee un tamaño de 112 nucleótidos: 38 nt del extremo 3primadel orf 4 seguidos de 38 nt de la región utr más 36 nt del extremo 5prima de la cp. A continuación, con el fin de evitar duplicaciones de secuencias, se ensayó la construcción pbpepgfpdeltacpch2, en la cual la gfp fue situada bajo el control del supuesto promotor del rna subgenómico de la cp del aislado pepmv-ch2. Los resultados obtenidos con esta construcción demostraron que a través de una secuencia control heteróloga también es posible expresar un gen foráneo desde el genoma de pepmv.
Datos académicos de la tesis doctoral «El virus del mosaico del pepino dulce (pepmv): desarrollo de un vector viral y resistencia genética en tomate«
- Título de la tesis: El virus del mosaico del pepino dulce (pepmv): desarrollo de un vector viral y resistencia genética en tomate
- Autor: Raquel Navarro Sempere
- Universidad: Miguel hernández de elche
- Fecha de lectura de la tesis: 09/07/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Miguel Angel Aranda Regules
- Tribunal
- Presidente del tribunal: fernando Ponz ascaso
- amelia Sánchez pina (vocal)
- María José Diez niclos (vocal)
- nuria Alburquerque ferrando (vocal)