Tesis doctoral de Antonio Manuel Barrientos Duran
En la era de la secuenciación genómica uno de los grandes retos es el de encontrar las vías más adecuadas para analizar e interpretar la ingente cantidad de información disponible sobre secuencias de adn, para mejorar nuestro conocimiento acerca de la biología de estos organismos vivos. En este contexto, es crucial el desarrollo de nuevas herramientas genéticas que nos permitan de una forma rápida y suficientemente versátil el análisis de la función de los correspondientes genes, tales como marcadores moleculares y nuevas metodologías de mutagénesis por inserción. Por este motivo, una de las líneas de investigación propuestas por el equipo del profesor nicolás toro garcía fue el desarrollo de nuevas herramientas genéticas basadas en intrones del grupo ii para la identificación y el análisis funcional de genes en genomas de interés. los intrones del grupo ii son arns catalíticos y retroelementos móviles capaces de insertarse en sitios diana específicos del adn. El hecho de que puedan insertarse dentro de ellos secuencias de adn, incluso genes; la posibilidad de ser rediseñados de modo que se puedan insertar virtualmente en cualquier secuencia de adn elegida, en ausencia de recombinación homóloga, simplemente modificando el arn del intrón, junto con la alta frecuencia de inserción y especificidad, hace que estos elementos genéticos tengan una enorme potencialidad en ingeniería genética, en el análisis funcional de genomas y terapia génica. De todos los intrones del grupo ii conocidos en la actualidad sólo se ha podido demostrar que son móviles dos intrones de mitocondria de levadura denominados ai1 y ai2, un intrón bacteriano aislado de lactococcus lactis, ll.Ltrb y otro identificado por nuestro grupo en la bacteria simbiótica fijadora del nitrógeno atmosférico sinorhizobium meliloti, conocido como rmint1. el objetivo general de esta tesis doctoral es desarrollar herramientas genéticas basadas en intrones del grupo ii para la identificación y el análisis funcional de genes en genomas de interés. Se empleó la bacteria simbiótica fijadora del nitrógeno atmosférico s. Meliloti cuyo genoma ha sido secuenciado recientemente, por su interés tanto en agricultura como en medio ambiente, y e. Coli como microorganismo modelo. los objetivos específicos del proyecto fueron: 1. Estudio del mecanismo de movilidad del intrón del grupo ii, rmint1. 2. Profundización en los mecanismos de reconocimiento del adn diana como base para el diseño de intrones capaces de invadir específicamente secuencias elegidas en el genoma. 3. Estudio de los nucleótidos críticos, pertenecientes a la región de los exones, en el proceso de maduración o splicing del intrón del grupo ii rmint1. 4. Estudio de la movilidad del intrón rmint1 en un microorganismo modelo como e. Coli. Creación de un nuevo sistema de detección de eventos de invasión. Hasta la realización de este trabajo los eventos de invasión de la diana específica del intrón del grupo ii rmint1 eran detectados mediante hibridación usando para ello sonda específicas del intrón, o bien utilizándose sondas pertenecientes a la secuencia de inserción isrm2011-2 que incluían la diana de invasión específica de éste, las cuales, además, permiten la cuantificación de la fracción de plásmido receptor invadida por el intrón. Los ensayos de movilidad realizados por hibridación, no habían tenido éxito en un fondo genético como e. Coli. Por este motivo se elaboró un nuevo sistema de detección de eventos de invasión en un microorganimo modelo como e.Coli basado en construcciones tipo ¿orf, donadoras de intrón, poseedoras de la región promotora de la transcripción de la arn polimerasa del bacteriófago t7, y construcciones receptoras que contienen tanto la diana específica de rmint1 como un gen, silenciado, de resistencia a tetraciclina flanqueados ambos por terminadores de transcripción. La invasión del intrón con el promotor t7 en su interior activó la transcripción por parte de la arn polimerasa del fago t7 del gen de resistencia a tetraciclina, portado por la construcción receptora. Dicha resistencia se manifestó en experimentos de resistencia en placa, en un fondo genético tipo cepa hms174 de3 de e. Coli, en cuyo genoma se encuentra el gen codificador de la arn polimerasa vírica. 5. Diseño de intrones derivados de rmint1 que invadan específicamente genes de interés en s. Meliloti. Dado que los intrones del grupo ii reconocen sus adns diana, principalmente por apareamiento con el arn del intrón, éstos pueden ser dirigidos para insertarse dentro de diferentes sitios diana de adn simplemente por modificación del arn del intrón. Esta característica, además de su alta frecuencia de inserción y especificidad, hace posible usar a los intrones del grupo ii como vectores programables o targetrons, hacia genes dianas cromosómicos o bien portados en vectores plasmídicos. Así, se propuso generar targetrones derivados del intrón rmint1 de s. Meliloti usados para la interrupción eficiente de un gen diana. Muchos son los candidatos posibles para ser interrumpidos por rmint1. Uno de ellos, es el gen puta, que codifica la enzima prolina deshidrogenasa (pdh) implicada en la oxidación de prolina hasta glutamato en la bacteria s. Meliloti. Una vez definidas las dianas internas del gen puta, se procederá a la generación de los intrones modificados, con los cambios específicos en las secuencias ebss, complementarios a estas dianas. los experimentos de movilidad se realizaron entre plásmidos donadores y receptores, portadores de los intrones derivados de rmint1 y las secuencias dianas del gen puta, respectivamente, en ambos fondos genéticos, s. Meliloti y e. Coli. La detección de tales eventos se realizó mediante hibridación con sondas específicas de intrón y mediante la adquisición del fenotipo de resistencia al antibiótico tetraciclina, en el caso de e. Coli.
Datos académicos de la tesis doctoral «Bases moleculares para la aplicación biotecnológica del intrón del grupo ii rmint1 de sinorhizobium meliloti«
- Título de la tesis: Bases moleculares para la aplicación biotecnológica del intrón del grupo ii rmint1 de sinorhizobium meliloti
- Autor: Antonio Manuel Barrientos Duran
- Universidad: Granada
- Fecha de lectura de la tesis: 25/02/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Nicolás Toro García
- Tribunal
- Presidente del tribunal: José María Arias peñalver
- María trinidad Gallegos fernández (vocal)
- agustín Vioque peña (vocal)
- José lgnacio Jiménez zurdo (vocal)