Tesis doctoral de María Angeles Fernandez Bodega
Para la realización de la presente tesis doctoral se han tenido en cuenta dos de los aspectos más característicos de la especie fúngica penicillium roqueforti. En primer lugar, su uso en la industria alimentaria como principal microorganismo utilizado en la elaboración del queso azul. Y en segundo lugar su capacidad para sintetizar toda una serie de metabolitos secundarios tóxicos, conocidos con el nombre de micotoxinas. p. Roqueforti es el hongo utilizado desde la antigí¼edad en la fabricación de quesos azules. En la región de los picos de europa se producen quesos azules tanto de manera artesanal, como de forma industrial. En el primer caso el queso es colonizado por la cepa o cepas fúngicas autóctonas durante su maduración en cuevas naturales de la zona, mientras que en los quesos elaborados de manera industrial, el hongo es adicionado a la leche en forma de un preparado comercial de esporas. en el presente trabajo se han aislado cepas de p. Roqueforti a partir de cuatro variedades españolas de queso azul, tres variedades artesanales (cabrales, bejes-tresviso y valdeón) y una variedad de queso azul elaborada de forma industrial (valdeón industrial). Se comprobó que todas las cepas de p. Roqueforti aisladas de las variedades de queso azul y la cepa utilizada como control, p. Roqueforti cect 2905, presentan las características morfológicas típicas descritas para este hongo filamentoso, después de un periodo de incubación de 7 días a 25 º c en los medios de cultivo cya y mea. Además, el análisis de las secuencias correspondientes al adn que codifica el arn ribosomal confirmó que todas las cepas aisladas pertenecen a la especie p. Roqueforti. Por otro lado, el análisis del perfil de restricción del adn mitocondrial permitió diferenciar, en primer lugar, las cepas aisladas del queso de la cepa control, p. Roqueforti cect 2905; en segundo lugar permitió distinguir las cepas presentes en las variedades artesanales de queso con respecto a la cepa utilizada en la elaboración industrial. Finalmente, el análisis fenotípico de cada una de las cepas (análisis de las actividades proteolítica y lipolítica, secreción de aspartil-proteasa y análisis de la producción de andrastinas y micotoxinas) confirmó las diferencias que existen entre la cepa utilizada en la fabricación industrial del queso azul y el conjunto de cepas aisladas de las variedades artesanales. entre las micotoxinas producidas por p. Roqueforti se encuentran la toxina pr, y la roquefortina c. La roquefortina c, presente en el queso azul en concentraciones muy bajas, es una micotoxina neurotóxica, mientras que la toxina pr, que sufre un proceso de degradación durante la maduración del queso azul, tiene actividad mutagénica. Ambas micotoxinas son producidas también por el hongo p. Chrysogenum, cuyo genoma ha sido recientemente secuenciado (van den berg, et al., 2008). Este hecho facilita en gran medida el estudio de la ruta de biosíntesis de estas dos micotoxinas en ambas especies del género penicillium. en el presente trabajo se han obtenido mutantes no productores de aristoloqueno y toxina pr en la cepa p. Roqueforti cect 2905 por silenciamiento del gen ari1, resultado que verificó la hipótesis de que en p. Roqueforti el aristoloqueno es la molécula precursora de toxina pr. Por su parte, p. Chrysogenum wisconsin 54-1255 presenta una copia homologa a la del gen ari1 de p. Roqueforti y su nivel de expresión es similar en ambos hongos. Sin embargo, no ha sido posible detectar la producción de aristoloqueno ni de toxina pr en p. Chrysogenum mediante cromatografía en capa fina, utilizando las condiciones de cultivo puestas a punto para el caso de p. Roqueforti. en cuanto al estudio de la biosíntesis de roquefortina c, se ha encontrado en el genoma de la cepa p. Chrysogenum wisconsin 54-1255 una agrupación génica presumiblemente implicada en la biosíntesis de roquefortina c y meleagrina. Esta agrupación incluye los genes dmaw2 y dps que codifican respectivamente una dimetilaliltriptófano-sintasa y una dipéptido sintetasa. El análisis de la citada agrupación génica y de la estructura secundaria de estas proteínas permitió dilucidar la ruta de biosíntesis de roquefortinac/meleagrina en el citado hongo. Esta ruta se confirmo gracias a la obtención de mutantes de p. Chrysogenum silenciados en los genes dmaw2 y dps cuya producción de roquefortina c y meleagrina era sustancialmente menor a la cuantificada en la cepa control p. Chrysogenum wisconsin 54-1255. Finalmente, se han identificado también en el genoma de p. Roqueforti cect 2905 dos genes, dmaw2 y dps, homólogos a los que codifican la dimetilaliltriptófano-sintasa y la dipéptido sintetasa implicadas en la síntesis de roquefortina c y meleagrina en p. Chrysogenum. Además, p. Roqueforti posee un segundo gen dmaw, dmaw1, que presenta homología con las dimetilaliltriptófano-sintasas implicadas en la biosíntesis de ergoalcaloides en claviceps purpurea y aspergillus fumigatus. El silenciamiento del gen dmaw1 en la cepa p. Roqueforti cect 2905 afecta también a la producción de roquefortina c y otra serie de compuestos alcaloides, pero no a la producción de meleagrina. Por lo que se piensa que en p. Roqueforti la dimetialaliltriptófano-sintasa implicada en la síntesis de meleagrina, esta codificada por el gen denominado dmaw2, al igual que ocurre en p. Chrysogenum.
Datos académicos de la tesis doctoral «Aislamiento y caracterizacion de cepas de penicillium roqueforti a partir de distintas variedades de queso azul. análisis de la actividad proteolítica y eliminación de la producción de micotoxinas.«
- Título de la tesis: Aislamiento y caracterizacion de cepas de penicillium roqueforti a partir de distintas variedades de queso azul. análisis de la actividad proteolítica y eliminación de la producción de micotoxinas.
- Autor: María Angeles Fernandez Bodega
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 16/04/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ana Gómez Rodríguez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Miguel angel Asensio perez
- José Luis Barrero fuente (vocal)
- baltasar Mayo pérez (vocal)
- Juan José Rubio coque (vocal)